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Entwicklung und Anwendung synthetischer RNA-Schalter zur Regulation der Genexpression

Rudolph, Michael Martin :
Entwicklung und Anwendung synthetischer RNA-Schalter zur Regulation der Genexpression.
Technische Universität Darmstadt, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2016)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Entwicklung und Anwendung synthetischer RNA-Schalter zur Regulation der Genexpression
Language: German
Abstract:

Der genetische Werkzeugkasten des relativ jungen Forschungsgebietes der Synthetischen Biologie wird ständig durch neue Bauteile erweitert, wobei in den letzten Jahren verstärkt die Anwendung RNA-basierter Regulationselemente in den Fokus gerückt ist. In dieser Arbeit wird die Entwicklung und Anwendbarkeit dieser sogenannten synthetischen Riboswitche zur konditionalen Genexpression für verschiedene Organismen beschrieben. Im ersten Teil wird die in vitro-Selektion (SELEX) von RNA-Aptameren gezeigt, die als sensorische Domänen zum Aufbau dieser Riboswitche genutzt werden können. Als Zielsubstanzen dienten dabei Azobenzole. Das sind photochrome Moleküle, die eine reversible Konformationsänderung durch Licht unterschiedlicher Wellenlängenbereiche erfahren. Die Selektionen hatten dabei das Ziel der Anreicherung photoschaltbarer Aptamer-Liganden-komplexe, wobei die jeweiligen trans-Isomere bevorzugt werden sollten. Zunächst wurde eine in vitro-Selektion gegen das Azobenzol TH72 unter Verwendung paramagnetischer streptavidinbeschichteter Partikel durchgeführt. Hier wurde eine Anreicherung bindender RNA-Spezies erzielt, welche jedoch nicht imstande waren, das freie Zielmolekül zu erkennen, sondern eine Abhängigkeit zur Selektionsmatrix aufwiesen. Durch eine SELEX mittels säulenbasierter Affinitätschromatographie gegen die mit einer Chloramphenicoleinheit substituierten Azobenzole TH-CA bzw. TH-CA-Amino wurden indes Aptamere identifiziert, welche freie Zielmoleküle binden konnten und sich durch Dissoziationskonstanten im niedrigen mikromolaren Bereich auszeichneten (Kd = 0,8 – 3,6 µM). Für die Aptamere 42 und 42_V1 wurden darüber hinaus lichtabhängige Bindeverhalten gezeigt, wobei die cis-Isomere der Azobenzole nicht oder nur sehr schwach gebunden wurden. Ein erster Konstruktionsversuch azobenzolabhängiger Riboswitche im Hefetestsystem war noch nicht zielführend. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einsatz synthetischer theophyllinabhängiger Riboswitche zur konditionalen Genexpression in Streptomyces coelicolor geprüft. Die von Justin P. Gallivan entwickelten RNA-Schalter ließen sich mit allen drei getesteten Promotoren galP2, ermEp1 und SF14 kombinieren. Hierdurch konnten insbesondere die Riboswitche A und E* als robuste Schaltelemente identifiziert werden, welche eine 30- bis 260-fache Aktivierung der ß-Glucuronidaseexpression zuließen. Mit Riboswitch E* ließ sich darüber hinaus zeigen, dass die Genexpression dosisabhängig und zu bestimmten Zeitpunkten der Kultivierung kontrolliert werden konnte. Das Riboswitchsystem zeichnete sich somit als leicht zu implementierende, modular kombinierbare und zudem robuste Methode zur konditionalen Genexpression aus und könnte auch für diverse native und heterologe Proteine in anderen Streptomyces-Arten zur Anwendung kommen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The genetic toolbox of the relatively young research field of synthetic biology is constantly expanded by new components. In recent years, the application of RNA-based regulatory elements is increasingly brought into focus. In this work the development and application of these so-called synthetic riboswitches for conditional gene expression for various organisms is described. In the first part the in vitro selection (SELEX) of RNA aptamers is shown. They can be used as sensory domains to build up riboswitches. Azobenzenes were used as target substances. These are photochromic molecules which undergo a reversible conformational change by light of different wavelength ranges. The goal of the selections was an enrichment of photoswitchable aptamer-ligand complexes, where the respective trans isomers should be preferred. First, an in vitro selection against the azobenzene TH72 was performed using streptavidin-coated paramagnetic particles. Here, an enrichment of binding RNA species was obtained which, however, were not able to recognize the free target molecule, but exhibited a dependency on the selection matrix. By means of column-based affinity SELEX against azobenzenes substituted with a chloramphenicol moiety (TH-CA or TH-CA-Amino) aptamers have been identified that could bind the free targets with dissociation constants in the low micromolar range (Kd = 0.8 to 3, 6 µM). For aptamers 42 and 42_V1 a light-dependent binding behavior was experimentally verified whereat the cis isomers of the azobenzenes were not or only weakly bound. A first attempt to construct azobenzene-dependent riboswitches in a yeast test system was not yet effective. In the second part of this work the use of synthetic theophylline-dependent riboswitches was tested for the conditional gene expression in Streptomyces coelicolor. The riboswitches developed by Justin P. Gallivan were combinable with all three tested promoters galP2, ermEp1 and SF14. Especially riboswitches A and E* could be identified as robust switching elements which allowed a 30- to 260-fold activation of ß-glucuronidase expression. For riboswitch E* it was demonstrated that gene expression could be controlled in a dose-dependent manner and at certain times of cultivation. The riboswitch system is an easy-to-deploy, modular and also robust method for conditional gene expression and could be used for a variety of native and heterologous proteins also in other Streptomyces species.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 06 Oct 2016 10:32
Last Modified: 06 Oct 2016 12:27
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-46421
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Refereed: 7 July 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4642
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