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Für die Erhaltung der genomischen Integrität einer Zelle ist das koordinierte Zusammenspiel von DNA-Doppelstrangbruch (DSB)-Reparatur und Zellzykluskontrolle von essentieller Bedeutung. Die Aktivierung des G2/M Checkpoints ist ein schneller Prozess, jedoch wird der Checkpoint bereits aufgehoben bevor die Reparatur abgeschlossen ist. Infolge dessen können Zellen mit einem erhöhten Level an DSBs in die Mitose eintreten. Frühere Arbeiten führten zu der Erkenntnis, dass in der späten G2-Phase DSBs überwiegend über den Weg der Homologen Rekombination (HR) repariert werden. Diese Beobachtungen ließen vermuten, dass das Aufheben des G2/M-Arrests vor Abschluss der Reparatur dazu führt, dass Zellen mit HR-Reparatur-Intermediaten in die Mitose eintreten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden DNA-Konstrukte hergestellt, welche es ermöglichen sollten, das Reparaturverhalten von HR-Faktoren (Rad51, Rad52, Rad54, Mus81) am Übergang von der G2 Phase in die Mitose genauer zu charakterisieren. Hierzu wurden basierend auf den Vektoren Zelllinien hergestellt und auf ihre Funktionalität hin untersucht. Einige der Zelllinien kamen bei der Beantwortung der nachfolgenden Fragestellung mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFM) und Lebendzellmikroskopie zum Einsatz. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob sich diese Intermediate in der Mitose nachweisen lassen und welche Faktoren weiterhin an der Reparatur beteiligt sind. Zudem sollte ein tieferer Einblick in die Struktur der Intermediate gewonnen werden.
Im Laufe dieser Arbeit konnte zunächst gezeigt werden, dass die bekannten HR-Faktoren Rad51 und Rad54 in der späten G2-Phase vom Chromatin dissoziieren und in der Mitose nicht an den DSBs lokalisieren. Im Gegensatz zu Rad51 und Rad54 ist nur wenig über die Rolle von Rad52 während der HR in Säugerzellen bekannt. Nach IR wird Rad52-GFP langsam rekrutiert und hat das Maximum zu späten Zeiten. Rad52 GFP-Foci kolokalisieren zudem in der späten G2-Phase mit Rad51-Foci und phosphoryliertem RPA (pRPA), was einen Hinweis auf eine Rolle von Rad52 in einem späten Schritt der HR liefert. Um festzustellen, ob eine Rad52 GFP-Foci-Ausbildung von vorangegangenen HR-Ereignissen abhängt, wurde Rad51 inhibiert. Interessanterweise nehmen die Foci Zahlen von Rad52-GFP und pRPA nach Rad51-Inhibition zu. Dies lässt darauf schließen, dass Rad52 auch eine Funktion unabhängig von einer vorhergehenden Rad51-Rekrutierung, dem Schlüsselschritt der HR, wahrnehmen kann. Ob diese Funktion identisch zu der zu späten Zeitpunkten in der G2-Phase in Rad51 profizienten Zellen ist, ist Gegenstand nachfolgender Projekte. Darüber hinaus sind die Rad52 Foci auch in der Pro- und in der Metaphase nachweisbar, wo sie mit der bekanntermaßen an der Auflösung sogenannter Chromatin entanglements beteiligten Nuklease Mus81 kolokalisieren. Dies bestätigt zum einen die Hypothese, dass HR-Intermediate in die Mitose eintreten, zum anderen deutet dies auf deren Auflösung hin. In der Arbeit werden verschiedene Modelle diskutiert, welche Rolle Rad52 bei der Reparatur in der späten G2 Phase und am Übergang in die Mitose einnehmen könnte.
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| Alternative Abstract: |
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The coordinated interplay of DNA double-strand break (DSB) repair and cell cycle control is essential for the maintenance of a cell's genomic integrity. The activation of the G2/M checkpoint is a fast process, but the checkpoint is abrogated before the repair is complete. As a result, cells can enter mitosis with an increased level of DSBs. Previous work led to the conclusion, that in late G2 phase DSBs are repaired predominantly by homologous recombination (HR). These observations suggested that the abrogation of the G2/M-arrest prior to the completion of DSB repair results in cells entering mitosis with HR repair-intermediates. In this work, DNA vectors have been constructed and used for establishing cell lines to characterize the repair behavior at the transition from the G2 phase into mitosis by immunofluorescence microscopy (IFM) and live cell microscopy. Moreover, it was investigated whether these intermediates could be detected in mitosis and what factors are still involved in the repair. Finally, the aim of this work was to get a deeper insight into the structure of the intermediates.
During this work it was first shown that the common HR factors Rad51 and Rad54 dissociate from chromatin in late G2 phase and cannot be detected at the DSBs in mitosis. In contrast to Rad51 and Rad54, only little is known about the role of Rad52 during HR in mammalian cells. After IR, Rad52-GFP is recruited slowly and has the maximum at later times. Rad52-GFP foci colocalize with Rad51 foci in late G2-phase, indicating a function of Rad52 in a late step of HR. In addition, the Rad52 foci are also detectable in metaphase, where they colocalize with the endonuclease Mus81 which is known for its involvement in the resolution of so-called chromatin entanglements. This confirms the hypothesis that HR intermediates enter mitosis. It was further shown that IR-dependent phosphorylated RPA (pRPA) co-localizes with Rad52-GFP in the course of the G2-phase. To determine whether Rad52-GFP foci formation depends on previous HR events, Rad51 was inhibited. Interestingly, the foci numbers of Rad52-GFP and pRPA are elevated due to Rad51 inhibition. This suggests that Rad52 also functions independently of a previous Rad51 recruitment, the key process of HR. Whether in this case the function of Rad52 is identical to that at later times in the G2-phase in Rad51-proficient cells, is the subject of subsequent projects. In this study, various models are discussed concerning the role of Rad52 in the transition of G2 phase induced DSBs into mitosis.
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