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Receptor-targeted viral vectors for basic and medical research

Muth, Anke :
Receptor-targeted viral vectors for basic and medical research.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Receptor-targeted viral vectors for basic and medical research
Language: English
Abstract:

Viral vectors are powerful tools for a steadily increasing number of applications in gene therapy and basic research. In recent years, many proof-of-concept studies and clinical trials resulted in important progress and benefit for patients. Strategies to customize viral vectors will be key to their future success. This thesis deals with viral vectors that were engineered to use a cell surface receptor of choice for cell entry. Such vectors can mediate a restricted gene delivery to a cell type defined by the targeted receptor. The first part of this thesis investigates lentiviral vectors (LVs) carrying engineered glycoproteins of measles virus (MV) to better understand the molecular events during particle cell entry that proceeds via membrane fusion. The second part focuses on adeno-associated viral vectors (AAV) which are non-enveloped particles. AAVs were engineered to assess their potential in detecting rare epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)-positive tumor cells. The first step of MV infection is attachment mediated by the hemagglutinin (H) to one of its receptors which is thought to produce conformational changes in the membrane fusion protein (F) that trigger insertion of its fusion peptide into the target cell membrane. This fusion triggering model was challenged in this thesis by uncoupling the receptor attachment and the fusion-helper function of H by introducing mutations that made it blind to its normal receptors. An artificial receptor attachment protein specific for Her2/neu was incorporated into the membranes of pseudotyped lentiviral particles as a separate transmembrane protein along with H and F. Surprisingly, these particles entered efficiently into Her2/neu-positive SK-OV-3 as well as CHO-Her2 cells. Cell entry was pH-independent, required high-affinity receptor binding and was strictly dependent on the presence of H and F. H-specific monoclonal antibodies as well as mutations in H interfering with H/F interactions blocked cell entry. The vector particles mediated stable and specific transfer of reporter genes into Her2/neu-positive human tumor cells also in vivo, while exhibiting improved infectivity and higher titers as compared to conventional Her2/neu-targeted vectors displaying the targeting ligand on H. Additionally, several other targeting ligands were tested in this setting. Extending the current model of MV cell entry, the data suggest that receptor binding of H is not required for its fusion-helper function but particle-cell contact in general may be sufficient to induce the conformational changes in the H/F complex and to activate membrane fusion. Towards applying AAV targeting technology for the detection, modification or elimination of rare cells expressing EpCAM, which is a marker of circulating tumor cells (CTC), AAVs displaying designed ankyrin repeat proteins (DARPins) specific for EpCAM were generated. The DARPin Ec1 was displayed on the particle surface and mediated EpCAM-specific gene transfer into receptor-positive cell lines which was further confirmed by competition experiments with the extracellular domain of EpCAM. Transduction was clearly receptor density-dependent and non-malignant EpCAM-positive primary cells were only poorly transducable ex vivo and in vivo. Performance of vector particles was further enhanced by ion metal affinity chromatography purification. To assess the potency of EpCAM-AAV in detecting rare EpCAM-positive tumor cells, low amounts of MDA-MB-453 tumor cells were mixed with isolated human PBMC. EpCAM-AAV tracked basically all of the tumor cells, even when these made up only 0.3% of the cell mixture. In a next step, the conditions of circulating tumor cells in whole blood were mimicked. As few as 150 tumor cells present in 7.5 milliliters of human blood were readily detected by EpCAM-AAV suggesting that targeted AAVs form a new tool for the detection of rare tumor cells. The work of this thesis clearly demonstrates that receptor targeting of enveloped and non-enveloped viral vectors is a flexible and versatile technique. Highlighting that both LVs and AAVs can be used not only as gene therapy vectors but also in virological research and diagnostics, these targeting systems open up new possibilities for a broad spectrum of applications.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Virale Vektoren haben sich als nützliche Hilfsmittel für eine immer größer werdende Zahl von Anwendungen in der Gentherapie aber auch in der Grundlagenforschung etabliert. In den letzten Jahren wurde die Weiterentwicklung dieser Vektoren von vielen Machbarkeits- und klinischen Studien vorangetrieben. Strategien um virale Vektoren so anzupassen, dass sie spezifische und individuelle Kriterien erfüllen, werden der Schlüssel zu ihrem weiteren Erfolg sein. Dies könnte zum Beispiel durch Ansteuern eines definierten Rezeptors und somit einen auf bestimmte Zelltypen begrenzten Gentransfer gewährleistet werden. Im ersten Teil dieser Dissertation wurden lentivirale Vektoren untersucht, die veränderte Glykoproteine des Masernvirus tragen, um die molekularen Ereignisse der Membranfusion während des Partikelzelleintritts besser zu verstehen. Im zweiten Teil stehen nicht-behüllte adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) im Fokus. Diese wurden so modifiziert, dass sie seltene Tumorzellen, die das epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) exprimieren, detektieren können. Der erste Schritt einer Masernvirusinfektion besteht in der durch das Hämagglutinin (H) vermittelten Anbindung an einen der natürlichen Rezeptoren. Es wird angenommen, dass dies Konformationsänderungen im Fusionsprotein (F) hervorruft, die dann das Einlagern des Fusionspeptids in die Zielzellmembran einleiten. Dieses Fusionsmodell wurde in der vorliegenden Arbeit hinterfragt, indem die Rezeptoranbindung und die Fusionshelferfunktion des H voneinander entkoppelt wurden. Hierfür wurden Mutationen im H eingeführt, die zu einer Verblindung für die natürlichen Rezeptoren führte. Stattdessen wurde ein artifizielles Rezeptoranbindungsprotein, welches spezifisch für Her2/neu ist, zusammen mit H und F in die Membran von pseudotypisierten lentiviralen Vektoren eingebaut. Überraschenderweise waren diese Partikel in der Lage sowohl in Her2/neu-positive SK-OV-3 als auch in CHO-Her2 Zellen einzudringen. Es konnte gezeigt werden, dass der Zelleintritt eine hoch-affine Rezeptoranbindung benötigte, pH unabhängig und grundsätzlich von der Anwesenheit von H und F abhängig war. H-spezifische monoklonale Antikörper so wie eine Mutation in H, welche die H/F Interaktion stört, blockierten den Zelleintritt. Die Vektorpartikel vermittelten stabilen und spezifischen Reportergentransfer in Her2/neu-positive humane Tumorzellen in vitro und in vivo und wiesen darüber hinaus eine erhöhte Infektiösität und höhere Titer als die konventionellen Her2/neu-Targetingvektoren auf. Zusätzlich wurden verschiedene andere Targetingliganden in diesem System getestet. Als Erweiterung des gegenwärtigen Masernviruszelleintrittmodells legen diese Daten nahe, dass Rezeptoranbindung des H für dessen Fusionshelferfunktion nicht benötigt wird. Der Kontakt zwischen Partikel und Zelle könnte ausreichend sein, um die Konformationsänderungen im H/F-Komplex hervorzurufen und die Membranfusion auszulösen. Ein erster Schritt zur Anwendung von AAV-Vektoren für die Detektion, Modifikation oder Eliminierung von seltenen Zellen, die EpCAM, einen Marker für zirkulierende Tumorzellen (CTC), exprimieren, war die Generierung von AAVs, die EpCAM-spezifische „designed ankyrin repeat proteins“ (DARPin) einbauen. Das DARPin Ec1 wurde auf der Kapsidoberfläche des AAV präsentiert und vermittelte spezifischen Gentransfer in EpCAM-positive Zelllinien, was durch Kompetitionsexperimente mit der extrazellulären Domäne von EpCAM bestätigt wurde. Die von EpCAM-AAV vermittelte Transduktion war eindeutig von der Rezeptordichte abhängig und außerdem in nicht-malignen, primären, EpCAM-positiven Zellen, sowohl ex vivo als auch in vivo, stark eingeschränkt. Des Weiteren konnte die Transduktionseffizienz von EpCAM-AAV durch die chromatographische Abtrennung von DARPin-defizienten AAV Partikeln, die bei der Vektorherstellung als Nebenprodukt entstehen, deutlich erhöht werden. Um das Potential von EpCAM-AAV zur Detektion von seltenen EpCAM-positiven Tumorzellen zu untersuchen, wurde eine geringe Anzahl von MDA-MB-453 Tumorzellen mit isolierten humanen „peripheral blood mononuclear cells“ (PBMCs) gemischt. Fast alle Tumorzellen wurden durch EpCAM-AAV transduziert, auch wenn sie nur 0.3% der Mischung ausmachten. Im nächsten Schritt wurde die Situation von CTCs im Vollblut nachgestellt. Auch wenn nur 150 Tumorzellen in 7.5 ml Blut vorhanden waren, konnten diese mit Hilfe von EpCAM-AAV nachgewiesen werden, was darauf schließen lässt, dass EpCAM-AAV zur Detektion von seltenen Tumorzellen verwendet werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren die Flexibilität und Vielseitigkeit des Rezeptortargetings von behüllten und nicht-behüllten viralen Vektoren. Die Tatsache, dass sowohl LVs als auch AAVs nicht nur als Gentherapievektor sondern auch für virologische Fragestellungen und Diagnoseverfahren verwendet werden können, unterstreicht, dass die Targetingsysteme für ein breites Spektrum von Anwendungen neue Möglichkeiten eröffnen. German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 17 Mar 2015 14:56
Last Modified: 17 Mar 2015 14:56
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-44470
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Kolmar, Prof. Dr. Harald and Buchholz, Prof. Dr. Christian
Refereed: 6 March 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4447
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