TU Darmstadt / ULB / TUprints

Genome-wide analysis of DNA damage and repair

Yu, Wei :
Genome-wide analysis of DNA damage and repair.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

[img]
Preview
Text
Wei_Yu_PhD_thesis.pdf
Available under Creative Commons Attribution Non-commercial No-derivatives 3.0 de.

Download (5MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Genome-wide analysis of DNA damage and repair
Language: English
Abstract:

In the first part of this thesis I studied the genome wide distribution of gammaH2AX, H2AX and H3 under physiological conditions and after 10 Gy X-ray exposure in HepG2 cells. This was done using a chromatin immune-precipitation approach coupled to massively parallel DNA sequencing (ChIP-seq). This method enables the mapping of sequences that are coupled to the above-mentioned histones to the genome and thus allows studying the DNA damage response with high resolution in a genome-wide manner. Using these data I could show that under physiological conditions neither H3, H2AX nor gammaH2AX are randomly distributed, but all three histone variants are overrepresented in euchromatic regions. But the relative gammaH2AX abundance (compared to H2AX) is inverted with a weak enrichment in heterochromatic areas. After exposure to ionizing radiation (IR) euchromatic areas show an overrepresentation at early time points, positively correlated to high GC content, transcription and H3K36me3 histone marks. In contrast at 24h an inverted gammaH2AX distribution becomes apparent, with correlation to H3K9me3 histone marks, low GC content and non-genic regions. Detailed analysis revealed that the expression level influences the phosphorylation levels at early time points in genic regions and that intermediately expressed genes show the strongest response. The analysis of repetitive elements revealed that different repetitive elements respond either according to their GC content, e.g. ALUs, or independent of their GC content but rather directed by their secondary structure, e.g. satellite repeats. The second part of the thesis was aimed to study the genome-wide distribution of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) following UVC exposure. Therefore a modified DNA immunoprecipitation technique was developed to combine with high-throughput sequencing that provided strand specific information (ssDIP-seq). The induction and persistence of a major DNA photo-lesion CPDs are thought to affect transcription, induce mutagenesis and finally contribute to skin cancer. Since CPDs can be repaired by two different sub-branches of the nucleotide excision repair pathway (NER), namely a XPC dependent global genomic (GG-NER) and CSB dependent transcription coupled NER (TC-NER), we studied the CPD repair in a NER proficient (HaCaT) and a XPC deficient cell line. The XPC-/- cells show higher levels of endogenous copy number variations than HaCaT cells and thus support the idea that repair deficiency might contribute to genomic aberrations. Chromosomes 16, 17, 19, X with high densities of microsatellites show resistance of CPD repair in a chromosome-specific manner. The motifs of CPD hotspots are confirmed as continuous di-pyrimidine dimers and CPD distribution analysis revealed a non-random dispersal with preferential enrichment in repetitive regions especially in microsatellite and low complexity repeats. In genic regions, CPDs are distributed in a strand-specific manner and CPDs are overrepresented in the anti-sense strand rather than the sense strand, gradient increase from transcription start to stop site of the sense strand and anti-correlated to the expression levels. The chromatin feature analysis around the CPD hotspots shows that condensed chromatin does not inhibit the formation of CPDs but hinders the repair process. Furthermore, histone marks for euchromatin are underrepresented around CPDs and heterochromatin is slightly enriched. This validates that a majority of un-repaired CPDs are located inside of heterochromatic regions and are deplete in regions with euchromatin histone modifications. And this tendency is enhanced in repair deficient cells at late repair time points.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Im ersten Teil dieser Arbeit untersuchte ich in HepG2 Zellen die genom-weite Verteilung von gamma H2AX, H2AX und H3 sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch nach einer Bestrahlung mit 10Gy Röntgenstrahlung. Diese Untersuchungen wurden mittels Chromatin-Immunopräzipitation gefolgt von Hochdurchsatzsequenzierung durchgeführt (ChIP-seq). Dieser Ansatz ermöglicht es DNA Fragmente anzureichern die an die oben genannten Histon gebunden sind und diese im Genom zu kartieren, sodass sich die Untersuchungen mit hoher Auflösung genom-weit durchführen lassen. Auf diesen Daten basieren konnte ich zeigen, dass unter physiologischen Bedingungen weder H3, noch H2AX noch gamma H2AX zufällig im Genom verteilt sind, sondern, dass alle drei Histon Varianten überrepräsentiert in euchromaticshen Bereichen vorliegen. Betrachtet man allerdings den relativen Anteil an gamma H2AX in Bezug auf H2AX so stellt man eine umgekehrte Verteilung mit einer leichten Überrepräsentation im Heterochromatin fest. Nach der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zeigen euchromatische Genomregionen bei frühen Zeitpunkten eine höhere Häufigkeit für gamma H2AX an. Dies ist korreliert mit einem hohen GC Gehalt, aktiver Transkription und einer H3K36me3 Histonmethylierung. Im Gegensatz dazu zeigt sich nach 24h eine inverse gamma H2AX Verteilung, mit einer positiven Korrelation zu H3K9me3 Histonmodifikationen, einem niederen GC Gehalt und nicht-codierenden Regionen. Eine detaillierte Analyse zeigte, dass die Stärke der Transkription die gamma H2AX Phosphorylierung in Genregionen bei frühen Zeitpunkten beeinflusst. Die Analyse von Repetitiven Elementen zeigte, dass diese entweder entsprechende ihrem GC Gehalt (z.B. Alu Elemente) wie die anderen genomischen Elemente sich in Bezug auf ihre gamma H2AX Antwort verhalten, oder unabhängig vom GC Gehalt verhalten, wobei dann die gamma H2AX Antwort von der z.B. kompakten Sekundärstruktur der repetitive Elemente geprägt ist (z.B. Satellite Repeates). Der zweite Teil der Arbeit zielte darauf ab die Genome weite Verteilung der DNA-Läsion Cyclobutane Pyrimidin Dimer (CPD) zu untersuchen. Dafür entwickelte ich eine modifizierte Version der Immunopräzipitations Technik, welche Strangspezifische DNA Sequenzinformationen liefert (ssDIP-seq). Die Induktion und Persistenz einer der wichtigsten DNA-Photo-Schäden CPDs sind dafür bekannt, dass sie die Transcription beeinflussen, Mutagenese induzieren und schlussendlich zu Hautkrebsentstehung beitragen. Da CPDs durch zwei unterschiedliche Unter-Reparaturwege der Nukleotid Exzissions Reparatur (NER) entfernt werden können, nämlich der XPC abhängigen global genomischen (GG-NER) und der CSB abhängigen transkriptionsgekoppelten (TC-NER), untersuchten wir die CPD Reparatur in einer NER PRofizienten (HaCAT) und einer XPC defizienten Zell Linie. Die XPC-/- Zellen zeigten eine erhöhte Menge an endogenen „Copy Number Variations“ als die Zellinie HaCaT. Damit wird die Theorie unterstützt, dass DNA Reparaturdefizienz zu genomischen Aberrationen führt. Die Chromosomen 16, 17, 19 und X weisen eine hohe Dichte an Mikrosatellit DNA auf und erweisen sich im Verlauf der CPD Reparatur als sehr reparatur-resistent. Die Analyse der VCPD Hotspot Motive bestätigte, dass CPDs bevorzugt in kontinuierlichen Di-Pyrimidinen liegt. Diese liegen nicht zufällig verteilt, bevorzugt in repetitiven Elementen des Genoms, vor allem in Mikrosatelliten und „low Complexity repeats“. In Genen sind CPDs strangspezifisch verteilt, wobei CPDs im nicht-codierenden Strang überrepräsentiert sind. Die CPD Verteilung nimmt vom Transkriptionsstart zum Transkriptionsende zu und ist insgesamt korreliert zum Expressionsspiegel. Die Analyse der Chromatinumgebung um die CPD Peaks herum zeigt, dass kondensiertes Chromatin die Induktion der CPDs nicht verhindert, aber den Reparaturprozess behindert. Darüber hinaus sind genom-weit euchromatische Markierungen in der Nachbarschaft zu CPDs unterrepräsentiert, während heterochromatische Markeirungen leicht angereichert sind. Diese bestätigt, dass nicht-reparierte CPDs vorwiegend in heterochromatischem Genomregionen liegen.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Cell Biology and Epigenetics
Date Deposited: 15 Jan 2015 15:39
Last Modified: 15 Jan 2015 15:39
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-43527
Referees: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina and Drossel, Prof. Dr. Barbara
Refereed: 17 December 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4352
Export:
Actions (login required)
View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year