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Analyse des Oberflächenproteoms von Hirnkapillarendothelzellen

Oppolzer, Thomas H. :
Analyse des Oberflächenproteoms von Hirnkapillarendothelzellen.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2004)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Analyse des Oberflächenproteoms von Hirnkapillarendothelzellen
Language: German
Abstract:

Das Vertebratengehirn stellt das am höchsten spezialisierte bekannte Organ dar. In seiner Funktion ist es extrem abhängig von einem konstanten physiologischen Milieu. Die Stabilität eines solchen Milieus, die Homöostase, ist vor allem zum Schutz des neuronalen Gewebes erforderlich. Zum einen muss die Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und Sauerstoff garantiert werden, andererseits muss das neuronale Gewebe vor potentiell im Blut gelösten Giftstoffen geschützt werden. Diese komplexe Schutz- und Versorgungsfunktion wird durch das kapilläre System des Gehirns wahrgenommen. Dessen mikrovaskuläres Endothel wird aufgrund seiner Schrankenfunktion als Blut-Hirn-Schranke (BHS) bezeichnet. Das Proteom der Hirnkapillarendothelzelle (BMEC) bedingt deren spezifische Eigenschaften und somit direkt die Selektivität der Blut-Hirn-Schranke. Die BHS ist vor allem aus pharmakologischer und medizinischer Sicht von Bedeutung. Spezielles Interesse gilt dabei der luminalen Plasmamembran der mikrovaskulären Hirnkapillarendothelzellen. Diese Membran stellt für im Blut gelöste Substanzen die erste Barriere bei der Passage der BHS dar. Die Proteine dieser Zellmembran sind maßgeblich beteiligt an zellulärer Kommunikation, an Transportprozessen und an der Ausbildung der tight junctions. Die Charakterisierung des Oberflächenproteoms der BMEC verspricht ein besseres Verständnis der Schrankenfunktion und könnte Wege zu deren pharmakologischen Modulation aufzeigen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Oberflächenproteom von BMEC analysiert. Hierzu wurde ein neuartiges Reagenz entwickelt, das die selektive Markierung der Oberflächenproteine lebender Zellen und die schonende Anreicherung ihrer Membranproteine ermöglichte. Die hierfür synthetisierte SNHS-ImBAS (Sulfo-NHS-Iminobiotinylaminocapronsäure) zeigte deutliche Vorteile gegenüber konventionellen Biotinylierungsreagenzien, sowohl auf der Ebene der Probenvorbereitung, als auch auf der Ebene der MALDI-MS-Analytik. Dieses zum Patent angemeldete Reagenz erwies sich in den durchgeführten Arbeiten als nicht cytotoxisch und als nicht membrangängig. Um es zur Analyse des Oberflächenproteoms vitaler BMEC einsetzen zu können, wurde dieser Zelltyp aus dem hochkomplexen Organ Gehirn isoliert und kultiviert. Die Kontrolle der Zellmaterials erfolgte mittels immunchemischer Nachweise von Markerproteinen. Nach einer präparativen Oberflächenmarkierung von BMEC wurden die Membranproteine angereichert und im SDS-Gel getrennt. Mittels eigens etablierter Affinitätsfärbungen konnten die selektiven Eigenschaften des Reagenzes und die erfolgreiche Anreicherung markierter Proteine belegt werden. Die Identifizierung der angereicherten Proteine erfolgte mittels MALDI-Massenspektrometrie und anschließender Datenbank-Recherche. Hierbei wurden insgesamt 45 Proteine identifiziert. Für die Hälfte dieser Proteine war eine Lokalisation an der Zelloberfläche beschrieben. Die Funktion und Lokalisation bei einem weiteren Viertel der Proteine waren unbekannt. Für die restlichen Proteine war eine intrazelluläre Lokalisation beschrieben. Die Expression von vier der identifizierten Proteine mit bekannter Funktion wurde mit ergänzenden Methoden in BMEC bestätigt. Hierbei handelte es sich um den Rezeptor Plexin B1, die sekretierte Protease MMP10 und die Transportproteine MRP2 (ABCC2) und ATP7b. Der zuletzt aufgeführte Kupfer-Transporter ATP7b konnte in verschiedenen Isoformen nachgewiesen werden, die sich von den humanen Sequenzen zum Teil deutlich unterschieden. Damit wurde mit der Entwicklung und dem Einsatz eines neuen, zum Patent angemeldeten Reagenzes ein Beitrag zur Aufklärung der Blut-Hirn-Schranke geleistet.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The brain represents the most specialised organ in vertebrates. It's function depends highly on the physiological environment within the cerebral tissue. The stable metabolic equilibrium in the brain plays a decisive role in the protection of the neuronal tissues. On the one hand the adequate supply with oxygene and nutrients must be ensured. On the other hand the brain tissue has to be protected against toxic compounds which the blood may contain. The brain is protected and supplied by a complex capillaric system. Due to it's protective function the microvascular endothelium is called the blood-brain barrier (BHS). This barrier is constituted by the brain microvessel endothelial cells (BMEC). The BHS and thus the BMEC's proteome are matters of particular interest from a medical or pharmacological point of view. The part of the BMEC´s membrane facing the blood stream is called the "luminal" membrane. This luminal membrane represents the first barrier for compounds dissolved in the blood during their passage from the blood to the brain. The proteins of this membrane are pivotal in processes of cellular communication, transport and maintenance of tight junction structures. The knowledge of these proteins involved in barrier function could lead to new approaches to modulate the BHS in a pharmacological way. Aim of this thesis was to examine the surface proteome of brain microvessel endothelial cells. Therefor, a new labeling reagent was developed to tag the plasma membrane proteins of vital cells selectively. The synthesised SNHS-ImBAS (Sulfo-NHS-iminobiotinylaminocaproic acid) offered advantages over conventional biotinylation reagents. SNHS-ImBAS was neither toxic nor membrane permeable thus it allowed a selective labeling of cell surface proteins. BMEC were isolated from porcine brain, cultivated and labeled with SNHS-ImBAS. The labeled membrane proteins were enriched by using methodes of affinity chromatography. Subsequent to the separation in SDS-Page these proteins were analyzed by using MALDI-mass spectrometry. The obtained spectra were used to perform database recherches in order to identify the proteins. Using this approach, 45 proteins could be identified of which 50 % were described as membrane, membrane associated or secreted proteins. About 27 % of the identified proteins were unknown so that their function remains unclear. Four proteins were chosen for further characterization. These were the receptor Plexin B1, the secreted protease MMP10 and the transporters MRP2 (ABCC2) and ATP7b. The last named protein ATP7b was involved in copper ion transport. In this work evidence could be provided for different isoforms of ATP7b on the level of RNA. These porcine sequences differed from human sequences in a significant way.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:21
Last Modified: 07 Dec 2012 11:50
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000430
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-4305
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Layer, Prof. Dr. Paul
Advisors: Gassen, Prof. Dr. Hans Günter
Refereed: 6 February 2004
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/430
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