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Homo-Oligomerization of the Activating Natural Killer Cell Receptor NKp30 Ectodomain Increases its Binding Affinity for Cellular Ligands

Herrmann, Julia :
Homo-Oligomerization of the Activating Natural Killer Cell Receptor NKp30 Ectodomain Increases its Binding Affinity for Cellular Ligands.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Homo-Oligomerization of the Activating Natural Killer Cell Receptor NKp30 Ectodomain Increases its Binding Affinity for Cellular Ligands
Language: English
Abstract:

Natural killer (NK) cells are large granular lymphocytes of the innate immune system that spontaneously kill foreign, tumor and virus-infected cells without prior sensitization. In addition, NK cells act as immune regulators by secretion of chemokines and cytokines as well as direct interaction with other immune cells such as dendritic cells. NK cell function is regulated by a balance between inhibitory and activating signals that are transduced into the cell upon target cell interaction. One of the major activating NK cell receptors is the natural cytotoxicity receptor NKp30. Notably, NKp30 plays a unique role since it is the only NK cell receptor involved in triggering NK cell-mediated cytotoxicity as well as shaping the adaptive immune response. Reduced NKp30 expression has clinical implications in patients with acute myeloid leukemia, cervical cancer, and high grade squamous intraepithelial lesions as well as gastrointestinal sarcoma. Furthermore, downregulation of NKp30 expression resulted in an impaired natural cytotoxicity against leukemia cells and was directly correlated with reduced survival. NKp30 is a type I transmembrane protein of approximately 30 kDa comprised of an I-type Ig-like ligand binding domain (LBD), a flexible membrane proximal stalk domain, a single transmembrane helix, and a short cytosolic tail. For intracellular signal transduction, NKp30 associates with the immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM)-bearing adaptor molecule CD3zeta via oppositely charged amino acid residues within their transmembrane domains. In 2011, the 3D structure of the NKp30LBD was solved in an unbound and a ligand-bound form. However, so far, only few cellular ligands (BAG-6 and B7-H6) have been discovered, and the molecular details of ligand recognition by NKp30 are poorly understood. Recently, it was shown that the membrane proximal stalk domain of NKp30 is important for efficient ligand binding and signaling with respect to its length and amino acid composition. Additionally, it was demonstrated that proper N-linked glycosylation of the ligand binding domain is essential for ligand binding. But it is still vague, how this germline-encoded receptor is able to recognize multiple nonrelated ligands. Interestingly, a crystallographic dimer of the NKp30 ectodomain was observed arguing for potential intrinsic capability to self-assemble. Moreover, a fraction of NKp30 expressed in E. coli forms oligomers as detected by size exclusion chromatography. The aim of this thesis was to identify structural models and mechanisms, which enable variations of the ligand binding interface of NKp30 to recognize a multiplicity of diverse ligands. In this respect, soluble NKp30 ectodomain variants as well as an anti-NKp30 antibody specifically recognizing an epitope within the LBD of NKp30 were generated for molecular and cellular investigation to address the intrinsic ability of NKp30 to form oligomers, which might impact ligand binding affinity and the efficiency of target cell killing by NK cells. In this thesis, it was demonstrated that baculovirus-infected insect cells were a suitable expression system to produce correctly folded, post-translationally modified and ligand binding-receptive NKp30 proteins, which were functionally equivalent to those derived from human expression hosts. Furthermore, a polyclonal anti-NKp30 antibody, which is specific for an epitope located within the NKp30LBD, was purified from the blood serum of a peptide-immunized rabbit and validated for several molecular and cellular applications. Based on soluble NKp30 proteins comprising either the entire NKp30 ectodomain (LBD and stalk domain) or the ligand binding domain alone, a concentration-dependent formation of NKp30 ectodomain homo-oligomers was found, which was effected by two specific binding sites, one present within the Ig domain of NKp30 and one within its membrane proximal stalk domain. Moreover, both NKp30 ectodomain variant oligomers were functional in ligand binding and contributed to a highaffinity interaction with its cellular ligand B7-H6, which was strongly promoted by the stalk domain. Although both NKp30 ectodomain variant oligomers formed spherical particles of the same diameter in solution, in presence of the stalk domain one oligomer was composed of more monomers. Single particle electron microscopy analyses revealed that the number of calculated 2D classes increased tremendously for the particles of the longer NKp30 ectodomain variant. Therefore, a densest packing of spheres for the monomers within both NKp30 ectodomain variant oligomers is suggested, whereas the flexibility of the stalk domain might allow for a more variable orientation of these monomers within the particle, thereby increasing the heterogeneity of structural arrangements. However, based on decoration experiments with soluble NKp30 ectodomain proteins and primary NK cells facilitating more physiological conditions for NKp30 self-assembly, an ordered arrangement of several NKp30 receptors on the plasma membrane in head-to-head orientation is proposed. Based on these data, oligomerization of the NKp30 ectodomain represents a potent mechanism to modulate the ligand binding affinity of NKp30 for corresponding ligands by increased avidity. Because the degree of oligomerization is dependent on the local receptor concentration, which is upregulated by IL-2 upon NK cell activation, oligomerization of NKp30 might be a molecular transformer of NK cell activation into enhanced cytotoxicity. Future experiments are now focused to investigate NKp30 self-assembly on the plasma membrane of NK cells to enable modulation of the cytotoxicity of NK cell based therapeutics.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind große, granuläre Lymphozyten des angeborenen Immunsystems, welche fremdartige, krankhaft veränderte sowie virus-infizierte Zellen spontan und ohne vorherige Sensibilisierung töten. Weiterhin agieren NK-Zellen durch Sekretion von Chemokinen und Zytokinen sowie durch direkte Interaktion mit anderen Immunzellen wie z.B. Dendritischen Zellen als Immunregulatoren. Ihre Funktion wird dabei durch ein Gleichgewicht zwischen inhibierenden und aktivierenden Signalen gesteuert, welche durch die Interaktion mit einer Zielzelle in das NK-Zellinnere übermittelt werden. Einer der wichtigsten aktivierenden NK-Zellrezeptoren ist NKp30, ein Mitglied der Familie der natürlichen Zytotoxizitätsrezeptoren (natural cytotoxicity receptors, NCRs). NKp30 ist einmalig unter den aktivierenden NK-Zellrezeptoren, da er als einziger sowohl die NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität auslöst als auch die erworbene Immunantwort beeinflusst. Eine verringerte NKp30 Expression hat klinische Folgen für Patienten, die an akuter myeloider Leukämie (AML), Gebärmutterhalskrebs, Plattenepithelkarzinom (high grade squamous intraepithelial lesions, HGSIL) oder auch Weichgewebstumoren (gastrointestinal sarcoma, GIST) erkrankt sind. Zudem resultiert aus der NKp30 Herunterregulation eine geringere natürliche Zytotoxizität gegenüber Leukämiezellen, welche direkt mit einer verringerten Überlebensrate korreliert. NKp30 ist ein Typ I Transmembranprotein von etwa 30 kDa, welches aus einer I-Typ Ig-ähnlichen Ligandenbindedomäne (LBD), einer flexiblen membrannahen Stalkdomäne, einer einzelnen Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen Schwanz aufgebaut ist. Um Signale im Zellinneren weiterleiten zu können, assoziiert NKp30 mit dem ITAM (immunoreceptor tyrosin-based activatin motif)-enthaltenden Adapterprotein CD3zeta über entgegengesetzt geladene Aminosäurereste innerhalb ihrer Transmembrandomänen. Im Jahr 2011 wurde die 3D-Struktur der Ligangenbindedomäne von NKp30 sowohl in einer ungebunden als auch einer Liganden-gebundenen Form gelöst. Da bisher nur wenige zelluläre Liganden (BAG-6, B7-H6) entdeckt wurden, sind die molekularen Einzelheiten der Ligandenerkennung durch NKp30 weitgehend unbekannt. Vor kurzem konnte jedoch gezeigt werden, dass sowohl die Länge als auch die Aminosäuresequenz der membrannahen Stalkdomäne von NKp30 bedeutsam für eine effiziente Ligandenbindung und Signalweiterleitung sind. Außerdem wurde bewiesen, dass eine korrekte N-verknüpfte Glykosylierung der LBD essentiell für die Ligandenbindung ist. Es bleibt aber weiterhin unklar, wodurch dieser keimbahn-kodierte Rezeptor in der Lage ist, verschiedene nicht verwandte Liganden zu erkennen. Interessanterweise wurde ein kristallographisches Dimer der NKp30 Ektodomäne beobachtet, was auf ein intrinsisches Potential zur Selbstassemblierung schließen lässt. Zudem konnte aus einer Präparation von NKp30 Protein, welches aus E. coli hergestellt wurde, mittels Größenausschlusschromatographie eine Oligomer-enthaltende Fraktion isoliert werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, strukturelle Modelle und Mechanismen zu identifizieren, welche eine Variabilität der Interaktionsfläche zwischen NKp30 und seinen Liganden ermöglicht, um eine Vielzahl von verschiedenen Liganden zu erkennen. Es wurden lösliche Varianten der NKp30 Ektodomäne sowie ein anti-NKp30 Antikörper, welcher spezifisch ein Epitop innerhalb der LBD von NKp30 erkennt, für molekulare und zelluläre Analysemethoden hergestellt. Mit Hilfe dieser Proteine wurde die intrinsische Fähigkeit von NKp30, Oligomere auszubilden, untersucht, welche die Ligandenbindeaffinität sowie auch die effiziente Zielzelltötung durch NK-Zellen beeinflussen könnte. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Baculovirus-infizierte Insektenzellen ein geeignetes Expressionssystem zur Herstellung von richtig gefalteten, post-translational modifizierten und ligandenbindungskompetenten NKp30 Proteinen sind, welche in ihrer Funktionalität den in humanen Expressionswirten hergestellten Proteinen gleichgestellt sind. Außerdem wurde ein polyklonaler anti-NKp30 Antikörper aus dem Blutserum eines Peptid-immunisierten Kaninchens gereinigt, welcher spezifisch ein in der NKp30LBD lokalisiertes Epitop erkennt, und für verschiedene molekulare und zelluläre Anwendungen validiert. Basierend auf löslichen NKp30 Proteinen, welche entweder die gesamte NKp30 Ektodomäne (LBD und Stalkdomäne) oder nur die LBD enthielten, wurde eine konzentrationsabhängige Ausbildung von Homo-Oligomeren der NKp30 Ektodomäne gefunden. Die Selbstassemblierung der NKp30 Ektodomäne wird durch zwei spezifische Bindestellen ermöglicht, welche sich in der Ig-Domäne sowie in der membrannahen Stalkdomäne von NKp30 befinden. Diese NKp30 Ektodomänenoligomere waren funktional hinsichtlich der Ligandenbindung und trugen zudem zu einer hoch-affinen Interaktion mit dem zellulären Liganden B7-H6 bei, welche besonders stark durch die Stalkdomäne begünstigt wurde. Obwohl beide NKp30 Ektodomänenoligomere in Lösung sphärische Partikel mit dem gleichen Durchmesser ausbildeten, waren die Oligomere bestehend aus der NKp30 Ektodomänvariante mit Stalkdomäne aus mehr Monomeren aufgebaut. Elektronenmikroskopische Untersuchungen von Einzelpartikeln ergaben zudem eine immens erhöhte Zahl berechneter 2D Klassen für die Oligomerpartikel der vollständigen NKp30 Ektodomäne. Daher wird für die Monomere beider NKp30 Ektodomänvarianten eine Anordnung in Form der dichtesten Kugelpackung vorgeschlagen. Aufgrund der Flexibilität der Stalkdomäne könnten vielfältigere Orientierungen der Monomere innerhalb der Partikel ermöglicht werden, wodurch sich die Heterogenität der strukturellen Anordnung weiter erhöht. Aufgrund von Dekorationsexperimenten mit löslichen NKp30 Ektodomänenproteinen und primären NK-Zellen, welche physiologischere Bedingungen für die NKp30 Selbstassemblierung widerspiegeln, wird jedoch eine geordnete Aneinanderreihung von NKp30 Rezeptoren in der Plasmamembran mit einer Kopf-an-Kopf-Orientierung zueinander vorgeschlagen. Basierend auf diesen Daten stellt die Oligomerisierung der NKp30 Ektodomäne einen wirksamen Mechanismus dar, um die Ligandenbindeaffinität von NKp30 durch zunehmende Avidität zu verstärken. Da der Grad der Oligomerisierung von der lokalen Rezeptorkonzentration abhängig ist, welche durch IL-2 während der NK-Zellaktivierung hochreguliert wird, könnte die Homo-Oligomerisierung von NKp30 ein molekularer Überträger der NK-Zellaktivierung zu verstärkter Zytotoxizität sein. Zukünftige Experimente sind nun auf die Untersuchung der NKp30 Selbstassemblierung auf der Plasmamembran von NK-Zellen ausgerichtet, um die Regulierung der Zytotoxizität von NK-Zell-basierten Therapien zu ermöglichen.German
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: NK Cell, NKp30, Homo-Oligomerization
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
NK-Zelle, NKp30, Homo-OligomerisierungGerman
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 10 Oct 2014 08:35
Last Modified: 10 Oct 2014 08:35
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-41887
Referees: Koch, Prof. Dr. Joachim
Refereed: 7 October 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4188
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