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Der Apoptoseinhibitor Survivin als molekulare Zielstruktur einer Modulation der intrinsischen Strahlenresistenz von Tumorzellen

Reichert, Sebastian :
Der Apoptoseinhibitor Survivin als molekulare Zielstruktur einer Modulation der intrinsischen Strahlenresistenz von Tumorzellen.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Der Apoptoseinhibitor Survivin als molekulare Zielstruktur einer Modulation der intrinsischen Strahlenresistenz von Tumorzellen
Language: German
Abstract:

Das Inhibitor of Apoptosis Protein Survivin spielt eine prominente Rolle in der Tumorbiologie. Als Paradebeispiel für ein multifunktionelles Protein ist es an der Regulation einer Vielzahl von zellulären Netzwerken, einschließlich der Tumorzellproliferation, der Apoptose und der Antwort auf ungünstige Umweltbedingungen beteiligt. Während es in Normalgewebe nur in wenigen Zelltypen exprimiert ist, findet man in allen bisher untersuchten humanen Tumorentitäten eine Re-Expression des Faktors. Dabei wird dessen Überexpression als prognostischer Marker für ein aggressives Tumorverhalten, eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Rezidiven und Fernmetastasen sowie ein vermindertes Überleben angesehen. Zudem spielt Survivin eine kritische Rolle in der Vermittlung einer Therapieresistenz von Tumorzellen, die auf der Hemmung von Apoptose und auf Caspase-unabhängigen Mechanismen wie einer Modulation der Zellteilung beruhen. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Dissertation war die Klärung der Frage, ob und in welchem Umfang die Bestrahlungsantwort modulierende Wirkung von Survivin auf der Regulation der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen beruht und welche molekulare Mechanismen daran beteiligt sind. Dabei gelang es mittels subzellulärer Fraktionierung, Ko- Immunpräzipitation und Immunfluoreszenzfärbung nach Bestrahlung eine rasche Translokation von Survivin in den Zellkern und eine direkte Interaktion des Proteins mit den DNA-Reparatur- komponenten MDC1, g-H2AX, 53BP1 und DNA-PKcs zu belegen. Eine siRNAvermittelte Suppression von Survivin führte zu einer erhöhten Anzahl von Phosphohiston g- H2AX und 53BP1 Foci als Ausdruck einer gehemmten DNA-Reparatur, während die Überexpression eines Survivin-GFP-Konstruktes eine verbesserte Reparaturkapazität zur Folge hatte. Funktionell korreliert dieses Verhalten mit einer verminderten Autophosphorylierung der DNA-PKcs an Serin 2056 und einer signifikant verminderten Kinaseaktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass Survivin an der Regulation der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen beteiligt ist und erweitern das Spektrum der vielfältigen Funktionen des Proteins. Neuartige, Survivin-assoziierte Therapiestrategien zur Überwindung eines strahlenresistenten Phänotyps könnten zu einer Steigerung der therapeutischen Wirksamkeit einer Strahlentherapie bei Glioblastom-Tumoren beitragen. Es wurden deshalb in einem zweiten Schwerpunkt ein radiosensibilisierender Effekt von Artesunat, einem halbsynthetischen Derivat der Naturkomponente Artemisinin, in Glioblastomzellen und mögliche zugrunde liegende Mechanismen untersucht. In Kombination von Artesunat mit ionisierender Bestrahlung konnte eine zeit- und dosisabhängige Hemmung der Survivin-Expression beobachtet werden, während die Expression von anderen Mitgliedern der IAP Protein Familie (XIAP, cIAP1, cIAP2) nicht beeinflusst war. Entsprechend der zuvor beschriebenen Funktionalität von Survivin führte dies zu einer gesteigerten Apoptoserate, Induktion eines Zellzyklusarrestes, gehemmter DNA-Reparatur und vermindertem klonogenen Zellüberleben. Diese Ergebnisse geben somit klare Hinweise darauf, dass eine Kombinationstherapie von Artesunat mit ionisierender Strahlung zu einem verbesserten Therapieansprechen beim Glioblastom beitragen könnte und erweitert das Repertoire möglicher Survivin-Antagonisten. Ein weiteres, bisher noch unbefriedigend gelöstes Problem in der Anwendung von Anti- Survivin-Therapieoptionen ist eine zellspezifische und effektive Applikation der Antagonisten in Tumorzellen. Einen möglichen innovativen Lösungsansatz bietet jedoch die Entwicklung von Nanopartikel-Trägersystemen, die mittels kovalenter Kopplung von Antikörpern gegen tumorrelevante Membranstrukturen/Rezeptoren eine erhöhte therapeutische Wirksamkeit ermöglichen könnten. In einen dritten Schwerpunkt der Arbeit wurde deshalb ein monoklonaler Antikörper (cmHsp70.1) gegen membranständiges Heat shock protein 70 an humane Serum Albumin-Nanopartikel gekoppelt, die mit Expressionplasmiden für Survivinspezifische miRNA-Konstrukte beladen waren. Im Vergleich zu einer Isotyp-Kontrolle oder zu plasmidfreien Nanopartikeln konnte nach Inkubation mit cmHsp70.1 konjugierten Nanopartikeln eine signifikant gesteigerte zelluläre Aufnahme und Suppression der Survivin Protein-Expression parallel zu einer erhöhten Caspase3/7 Aktivität, verminderter Zellproliferation und geringerem Überleben beobachtet werden. Die cmHsp70.1 Antikörper konjugierten Nanopartikel können somit als eine Basis für die Entwicklung innovativer Trägersysteme für den Tumorzelloptimierten Einsatz molekular-zielgerichteter Survivin- Antogonisten in der klinischen Anwendung angesehen werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Alterations in the expression of apoptosis-related proteins, like the inhibitor of apoptosis (IAP) protein family, display a pivotal pathway by which cancer cells acquire resistance to therapeutic treatment. Among this family, survivin, the smallest and structural unique member, deserves growing attention due to its universal over-expression in human tumors, and its prominent role in disparate networks of cellular division, intracellular signaling and apoptosis. Several preclinical studies have demonstrated that targeting survivin expression by the use of small interfering RNAs, dominant negative mutants, antisense-oligonucleotides and small molecule repressors sensitized tumor cells towards chemotherapy and irradiation and reduced tumor growth potential. Due to these properties, survivin has been proposed as a molecular target for anticancer therapies. Recent studies further revealed that radio-sensitization achieved by survivin inhibition seems to be multifaceted and involves caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. In general, an enhanced rate of apoptosis, and pronounced cell cycle arrest have been observed. More recently, a hampered DNA-damage response has been noted, indicating a distinct role of the protein in radiation-induced double strand break repair. These properties were linked to a nuclear import and physical interrelationship with members of the DNA-DSB repair machinery such as phospho-histone H2AX and DNA dependent Protein Kinase (DNA-PKcs). The applicability of survivin-driven strategies in clinical practice is currently under investigation as the first survivin inhibitors successfully entered phase I/II trials. Although these trials do not include radiation therapy at present, survivin inhibitors may represent a novel type of molecular antagonists to improve the effectiveness of radiation therapy or chemoradio- therapy.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 07 Oct 2014 14:33
Last Modified: 07 Oct 2014 14:33
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-41448
Referees: Löbrich, Prof Markus and Laube, Prof Bodo
Refereed: 9 October 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4144
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