TU Darmstadt / ULB / TUprints

The role of the inhibitor of apoptosis protein Survivin in cellular radiation response

Petraki, Chrysi Eirini :
The role of the inhibitor of apoptosis protein Survivin in cellular radiation response.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

[img]
Preview
Text
140627 my thesis for library new.pdf
Available under Only rights of use according to UrhG.

Download (2MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: The role of the inhibitor of apoptosis protein Survivin in cellular radiation response
Language: English
Abstract:

Survivin, the smallest and functionally unique member of the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family, is frequently overexpressed in malignant cells and has been acknowledged as a predictive molecular marker for metastases and cancer patient survival following radiation therapy. The role of this protein in cellular radiation response, however, far exceeds a simple inhibition of apoptotic cell death involving non-caspase dependent mechanisms such as regulation of cell cycle and DNA damage repair. To investigate in more detail the role of Survivin in cellular radiation response and tumour cell motility, the present study aimed to establish and stably express several Survivin enhanced green fluorescent protein (EGFP)-tagged deletion or phosphorylation mutant constructs in SW480 colorectal cancer cells. To this end, Survivin wild-type (Surv. wt) and recombinant proteins lacking the binding sites for X-linked IAP (XIAP), Microtubules and heat shock protein 90 (Hsp90) (Survivin ΔXIAP/ΔMicTub/ΔHsp90) or the baculovirus IAP repeat (BIR) domain (Survivin ΔBIR) as well as phosphorylation mutants for the sites S20, T34 and T117 (Survivin S20A/S20D/T34A/T34D/T117A/T117D) were expressed in a pEGFP-N1 vector system. Subsequently, these mutant clones were subjected to more physiologic three-dimensional (3D) colony forming assays, immunofluorescence staining of DNA double strand break markers γH2AX and 53BP1, analysis of cell cycle distribution, induction of apoptosis, caspase 3/7 activity and transmigration assays following irradiation with doses ranging from 1 to 6 Gy. While knockdown of endogenous Survivin by RNA interference (siRNA) resulted in a significantly decreased 3D radiation survival in line with elevated numbers of residual γH2AX/53BP1 foci in pEGFP-N1 vector control, Survivin ΔXIAP, ΔBIR and T34A clones, both radiation clonogenic survival and the capacity to regulate DNA repair was rescued in clones stably overexpressing Survivin wt, ΔMicTub, ΔHsp90 and Survivin T34D mutant cells. Moreover, deletion of the BIR domain, XIAP, Microtubules and Hsp90 binding sites resulted in a G2/M cell cycle arrest, an elevated percentage of apoptotic SubG1 cells, an increased caspase 3/7 activity and significantly hampered transmigration activity of SW480 cells following depletion of endogenous Survivin. On a molecular level, constructs derived from Survivin ΔXIAP and T34A phospho-mutant overexpressing clones did not co-immunoprecipitate with the DNA repair protein DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs), whereas Survivin wt and T34D constructs co-precipitated with the protein. These data confirm Survivin to act as a radiation resistance factor modulating cellular radiation response by multiple mechanisms including DNA DSB repair, induction of cell cycle arrest and apoptosis. It is for the first time indicated that Survivin’s XIAP binding and T34 phosphorylation sites, but not its Microtubules and Hsp90 binding sites, are essential for radiation clonogenic survival and modulation of DNA damage repair, at least in part by disturbing protein interaction with DNA-PKcs. On the contrary, XIAP, Hsp90 and Microtubules binding sites as well as the BIR domain were shown to be essential for proper cell cycle regulation, apoptosis inhibition and transmigration capacity of SW480 colorectal adenocarcinomas.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Survivin, das kleinste und funktionell einzigartige Mitglied der Inhibitor of Apoptosis Protein (IAP) Familie ist in der Mehrzahl maligner Zellen überexpremiert und stellt einen wesentlichen prädiktiven molekularen Marker für eine Metastasierung und das Überleben von Patienten nach Strahlentherapie dar. In diesem Zusammenhang wurde zudem gezeigt, dass die Rolle von Survivin in der zellulären Strahlenantwort weit über eine alleinige Hemmung der apoptotischen Reaktionskaskaden hinausgeht, sondern vielmehr auch Caspase-unabhängige Mechanismen wie eine Regulation des Zellzyklus und der Reparatur von DNA-Schäden beinhaltet. Um die Rolle von Survivin in der zellulären Strahlenantwort und Tumorzellmotilität detaillierter zu untersuchen, war es Ziel der vorliegenden Arbeit, eine Reihe von grün fluoreszierendes Protein (GFP) markierten Survivin Deletions- und Phosphorylierungsmutanten zu generieren und stabil exprimierende Klone kolorektaler SW480 Karzinomzellen herzustellen. Dazu wurden wildtyp-Survivin und rekombinante Proteine mit fehlenden Bindungsstellen für X-linked IAP (XIAP), Mikrotubuli, Hitzeschockprotein 90 (Surv-ΔXIAP/ΔMicTub/ΔHsp90), die Baculovirus IAP Repeat (BIR) Domäne (Surv-ΔBIR), sowie Mutanten der Phosphorylierungsstellen S20, T34 und T117 (Survivin S20A/ S20D/T34A/T34D/T117A/ T117D) in einem pEGFP-N1 Vektor System zur Expression gebracht. Anschließend wurden die Zellen unter physiologischen Bedingungen in drei-dimensionalen (3D) Koloniebildungstests eingesetzt, die Expression der DNA-Doppelstrangbruchmarker γH2AX und 53BP1 mittels Immunfluoreszenz quantifiziert und die Zellzyklusverteilung, Induktion von Apoptose und die Caspase 3/7 Aktivität bzw. die Transmigrationsfähigkeit nach Bestrahlung mit Dosen von 1 bis 6 Gy untersucht. Während die Hemmung von endogenem Survivin durch RNA-Interferenz (siRNA) zu einer signifikanten Minderung des 3D klonogenen Überlebens und einer erhöhten Anzahl residueller γH2AX/53BP1 Foci in pEGFP-N1 Kontrollvektor, Surv. ΔXIAP, Surv. ΔBIR und Surv. T34A transfizierten Zellen führte, konnte das radiogene Zellüberleben und die DNA-Reparaturkapazität in stabil Surv. wt, Surv. ΔMicTub, Surv. ΔHsp90 und Surv. T34D überexprimierenden Zellklonen rekonstituiert werden. Darüber hinaus führte die Deletion der BIR Domäne, der Mikrotubuli und der Hsp90 Bindungsstelle zur Induktion eines G2/M Zellzyklus-Arrestes, einem erhöhten Anteil apoptotischer SubG1 Zellen, einer gesteigerten Caspase 3/7 Aktivität und einer signifikanten Hemmung der Transmigration von SW480 Zellen nach Attenuation des endogenen Survivins. Auf molekularer Ebene gelang bei Konstrukten aus Surv. ΔXIAP and T34A Phospho-mutanten überexpremierenden Zellen keine Ko-Immunpräzipitation mit dem DNA Reparaturprotein DNA Proteinkinase (DNA-PKcs), während dies bei wt-Survivin Klonen sowie bei der T34D phospho-mimetischen Mutante möglich war. Zusammengefaßt bestätigen diese Daten die Aktivität von Survivin als Radioresistenzfaktor, der die zelluläre Bestrahlungsantwort durch multiple Mechanismen, einschließlich der DNA- Doppelstrangbruch-Reparatur und der Induktion eines Zellzyklus Arrestes und von Apoptose zu modulieren vermag. Darüber hinaus konnte hier erstmals gezeigt werden, dass die XIAP Bindungs- und T34 Phosphorylierungs-, nicht jedoch die Microtubuli und Hsp90 Bindungsstellen essentiell für das klonogene Zellüberleben nach Bestrahlung und die Modulation der DNA Schadensreparatur sind. Dies beruht, zumindest teilweise, auf der Beeinträchtigung der Interaktion mit dem Protein DNA-PKcs. Im Gegensatz dazu sind für die Regulation des Zellzklus, die Inhibition der Apoptose und das Migrationsverhalten der kolorektalen Adenokarzinomlinie SW480 sowohl die XIAP-, die Hsp90- und die Mikrotubuli-Bindungsstellen wie auch die BIR-Domäne wesentlich.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 10 Oct 2014 11:31
Last Modified: 10 Oct 2014 11:31
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-40347
Referees: Löbrich, Professor Markus and Cardoso, Professor Cristina
Refereed: 6 June 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4034
Export:
Actions (login required)
View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year