Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Induktion und Reparatur von DNA-Schäden. Eine wirkungsvolle Methode um dies in lebenden Zellen zu erforschen, ist die Laser-Mikrobestrahlung. Sie ermöglicht es, DNA-Schäden mit sehr hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu erzeugen. Die meisten Laser induzieren jedoch eine Mixtur unterschiedlichster DNA-Schäden und führen somit zu einer Aktivierung multipler DNA-Reparaturwege. Dies macht eine Untersuchung der Kinetik einzelner Reparaturwege unmöglich. Zur Lösung dieses Problems, etablierten wir eine neuartige Methode, indem wir mittels an verschiedenen konfokalen Mikroskopen vorhandenen Lasern Bedingungen erzeugten, die eine Aktivierung von definierten Reparaturwegen ermöglichen. Zur Erreichung dieses Ziels, exprimierten wir fluoreszenzmarkierte Proteine, die spezifisch für die unterschiedlichen Reparaturwegen in Säugetierzellen sind, und quantifizierten ihre Akkumulation nach Mikrobestrahlung mit Lasern verschiedenerWellenlängen (405, 488, 561, 633 nm). Als zusätzliche Validation wiesen wir die Produktion von unterschiedlichen DNA-Schäden mit einer Reihe spezifischer Marker (CPDs, TUNEL, gH2AX-foci) nach. Unsere Daten zeigten, dass nach Mikrobestrahlung mit einer Wellenlänge von 405 nm alle untersuchten Reparaturwege aktiviert wurden. Im Gegensatz hierzu führte die Mikrobestrahlung mit 488 oder 561 nm Wellenlängen zu einer selektiven Aktivierung der nicht prozessiven "short-patch" Basenexzisionsreparatur. Unter diesen Bedienungen ist es demnach möglich, nicht prozessive DNA-Reparaturwege von prozessiven wie "long-patch" Basenexzisionsreparatur, Nukleotidexzisionsreparatur und Doppelstrangbruch-Reparaturwegen, zu unterscheiden.

Wir nutzten die neu von uns entwickelte Mikrobestrahlungsstrategie, um Unterschiede in der Induktion und Reparatur von DNA-Schäden zwischen Eu- und Heterochromatinregionen zu untersuchen. Hoch kompaktiertes Heterochromatin wurde hierzu zunächst markiert und anschließend mikrobestrahlt. Wir konnten damit nachweisen, dass DNA-Reparaturfaktoren unterschiedlicher Reparaturwege innerhalb der Heterochromatinregionen rekrutiert werden und, dass Bedingungen die zu einer prozessiven DNA-Synthese führen in einer 2-fachen Erweiterung der Heterochromatinregion resultieren. Als zusätzlichen Nachweis applizierten wir zu den Zellen halogenierte Nucleotide unmittelbar vor Mikrobestrahlung und wiesen, durch die Inkorporation der modifizierten Nucleotide, prozessive DNA-Reparatur direkt innerhalb der Heterochromatinregionen nach. Diese Daten widersprechen der Hypothese, dass heterochromatische DNA-Schäden an der Peripherie der Region repariert werden, sondern zeigen dass DNA-Synthese direkt innerhalb Heterochromatinregionen stattfinden kann.

Darüber hinaus konnten wir unsere Mikrobestrahlungsstrategie einsetzen, um den kürzlich beschriebenen postreplikativen DNA-Reparaturweg Ribonukleotidexzisionsreparatur näher zu untersuchen. Es wird angenommen, dass dieser Reparaturweg die Millionen Ribonukleotide, die von DNA-Polymerasen während der DNA-Replikation misinkorporiert wurden, degradiert. Die Nuklease RNase H2 führt dabei den initialen Exzisionsschritt durch. Wir zeigten, dass RNase H2 nicht nur zu DNA-Replikations-Stellen, sondern auch zu Stellen mit prozessiver DNA-Reparatursynthese rekrutiert wird, was eine Aktivierung der Ribonukleotidexzisionsreparatur nicht nur nach DNA-Replikation sondern auch nach DNA-Reparatur nahelegt. Mutationen in RNase H2 führen zu der Autoimmunkrankheit „Aicardi-Goutieres-Syndrome“. Unsere Forschung konnte zeigen, dass Mutationen die Komplex Formierung, PCNA Bindung oder Katalyse beeinflussen zu einer Veränderung des Bindungs- und Mobilitätsverhalten an Replikations- und Reparaturstellen führen und konnten somit beitragen den zugrundeliegenden Krankheitsmechanismus besser zu verstehen.