Das zytotoxische T-Lymphozyten Antigen 4 (CTLA-4) wird auf der Oberfläche von aktivierten T-Zellen exprimiert und ist maßgeblich an der Kontrolle der Immunaktivierung beteiligt. Durch die Inhibition oder Aktivierung von CTLA-4 können verschiedene Therapieansätze generiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Isolierung und Charakterisierung von neuartigen Bindemolekülen des immunregulatorischen Rezeptors CTLA-4 beschrieben. Basierend auf dem Trypsin-Inhibitor MCoTI-II wurde hierfür eine kombinatorische Variantenbibliothek über Codon-basierte Synthese generiert. MCoTI-II gehört zur Familie der Cystinknoten-Miniproteine, die eine wichtige Molekülklasse in der diagnostischen und therapeutischen Anwendung sowie eine Schnittstelle zwischen Peptid- und Protein-basierten Medikamenten darstellen. Über die Selektion auf die Serinprotease Trypsin konnte die Funktionalität der Miniprotein-Bibliothek erfolgreich überprüft werden. Die darauffolgende Durchmusterung auf CTLA-4-Bindemoleküle erfolgte über fluorescence activated cell sorting (FACS) im yeast surface display (S. cerevisiae) und nach vier Sortierungsrunden wurden die isolierten Varianten analysiert. Ausgewählte Miniproteine wurden als Thioredoxin-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und zeigten eine mikromolare Bindungskonstante. Eine MCoTI-II Variante wurde mittels Festphasensynthese (SPPS) chemisch synthetisiert, oxidativ gefaltet und anschließend biochemisch charakterisiert. Sie zeigte eine apparente Bindungsaffinität von etwa 3,7 µM und ihre Spezifität konnte mittels Immunfluoreszenzmarkierung an CTLA-4-überexprimierenden CHO-K1-Zellen sowie CTLA-4-präsentierenden EBY100-Zellen via Fluoreszenzmikroskop und FACS bestätigt werden. Eine Optimierung der Bindungsaffinität wurde durch die systematische Evaluation von Aviditätseffekten mit Oligomeren angegangen. Die Oligomerisierung des Miniproteins via Avidin zeigte eine spezifische Bindungsaffinität zwischen 20 nM (Bio-Layer Interferometrie) und 160 nM (ELISA). Außerdem erfolgte die rekombinante Fusion des CTLA-4-bindenden Miniproteins in 4-facher Kopienzahl an einen humanen Fc-Teil und führte im Vergleich zum Miniprotein-Monomer zu einer ca. 15-fach verbesserten Affinität.