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Open tubular-Kapillaren für die Hochdruckflüssigchromatographie

Forster, Simon :
Open tubular-Kapillaren für die Hochdruckflüssigchromatographie.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Open tubular-Kapillaren für die Hochdruckflüssigchromatographie
Language: German
Abstract:

Miniaturisierte HPLC (high pressure liquid chromatography)-Systeme sind in der alltäglichen Anwendung noch eher selten vertreten. Die große Mehrheit der etablierten Methoden beinhalten 4,6 mm-Edelstahlsäulen. Moderne Anwendungsgebiete wie die Proteomforschung, Einzellanalysen oder klinische Applikationen könnten den Übergang solcher Formate von der Wissenschaft in die Praxis jedoch beschleunigen. Als größten Vorteil eines geringeren Säulenvolumens, direkte Konsequenz aller Miniaturisierungsansätze, kann die Verringerung des benötigten Injektionsvolumens und damit des Probenverbrauchs betrachtet werden. Besonders in probenlimitierten Separationsaufgaben ist eine Entwicklung hin zu kleineren Säulendimensionen unausweichlich. Neben dem naheliegendsten Prinzip des Packens poröser Partikel in fused silica-Kapillaren zählen ebenso monolithische in situ-Synthesen, Chips und open tubular (OT)-Kapillaren zur Klasse miniaturisierter Säulenformate. Letztere stellen heute das Standardformat in der Gaschromatographie dar, fristen in der Flüssigchromatographie jedoch ein auf die Wissenschaft beschränktes Randdasein. Zwar sind schon in den 1980er-Jahren die theoretischen Grundlagen für die Einschätzung des Leistungspotentials dieser Kapillarklasse gelegt worden, allein mangelt es bis heute an präparativen Fertigungstechniken zur Deposition eines dicken, homogenen, fest angebundenen und vollporösen Films an der Kapillarinnenwand. Präparative Verfahren aus den 1990er-Jahren boten mitunter vielversprechende Bodenzahlen, teilten jedoch durchweg das Problem zu geringer Retention bzw. impraktikabel geringer Beladungskapazität. Zusätzlich konnten zu dieser Zeit verfügbare Chromatographie-Instrumente nicht ohne weiteres Flussraten im nL/min-Bereich kontrollieren und Detektionsprobleme, aufgrund der sehr geringen Elutionsvolumina, spielten ebenfalls eine Rolle (moderne LC-Instrumente sind heute sehr viel besser für solche Dimensionen ausgelegt). Durch Übertragung der sehr detailliert untersuchten Sol-Gel-Synthese zur Herstellung von Silica-Monolithen (NAKANISHI-Prozess) auf sehr kleine Dimensionen („confined spaces“, z. B. Kapillaren mit 10-20 μm Innendurchmesser) konnte ein neues, statisches Verfahren zur open tubular-Synthese entwickelt werden. Die physikalische Grundlage für diesen Prozess ist durch die Besonderheiten der Kombination aus Phasenseparation und Sol-Gel-Übergang in kleinen Reaktionsräumen gegeben, welche statt in einer dreidimensionalen, korallenartigen und vor allem ungerichteten Morphologie des resultierenden Materials in einer Schichtbildung entlang der begrenzenden Fläche resultiert. Wenn diese begrenzende Fläche eine sehr kleine, aber mehrere Meter lange fused silica-Kapillare ist, kann die ca. 500 nm dicke, vollporöse Schicht im Anschluss als stationäre Phase in der Kapillar-HPLC genutzt werden. Die Durchmesserabhängigkeit dieses Effekts konnte durch Synthesen in 50, 20, 15 und 10 μm Innendurchmesser (ID)-Varianten gezeigt werden. Qualitative Struktureigenschaften wie Schichtdicke und optische Homogenität wurden durch Anwendung von Rasterelektronenmikroskopie auf den Kapillarquerschnitt zugänglich. Die spezifische Oberfläche sowie Mesoporosität des Materials konnte nur indirekt über Stickstoffsorptionsmessungen mit bulk-Vergleichsmaterial erfolgen (ca. 200 m²/g, ca. 10 nm Porendurchmesser). Die resultierenden Silica-Kapillaren wurden zur Trennung von Testgemischen sowie einfachen Applikationsbeispielen niedermolekularer Analyten (ca. 100-500 g/mol) in Normal- und Umkehrphase eingesetzt. Letztere wurde durch eine dem Herstellverfahren nachgeschaltete Octadecylsilan-Oberflächenmodifizierung ohne Endcapping-Schritt mit einem monofunktionellen Aminosilan realisiert. Es konnten zufriedenstellende Retentionsfaktoren im Umkehrphasen-Gradientenmodus in der (nicht Basislinien-)Trennung eines 32-Komponenten-Pestizidgemisches erhalten werden. Eine VAN DEEMTER-Auftragung für eine 15 μm ID-Variante wies ein Minimum von ca. 18 μm (Propylbenzol) für das Äquivalent eines theoretischen Bodens auf. Bezogen auf diese Bodenzahl/m-Bewertung sind open tubular-Kapillaren jedoch grundsätzlich nicht konkurrenzfähig, wird doch eine sehr wichtige Eigenschaft auf diese Weise nicht berücksichtigt: Die bis zu 600-fach höhere Permeabilität, im Vergleich mit jeweils einer partikelgepackten und monolithischen, kommerziell erhältlichen Silica-Kapillare, welche als Referenzsäulen fungierten. Erst die Leistungsbemessung nach einer kinetischen Optimierungsmethode, unter Berücksichtigung des deutlich reduzierten Fließwiderstands der OTs, ermöglichte eine faire Bewertung unter (für jede untersuche Kapillare) optimalen Bedingungen. Dies beinhaltete eine Auftragung der minimalen Analysenzeit, welche zum Erreichen einer erforderlichen Bodenzahl benötigt wird (kinetische Plots). Dieser Ansatz ist in der Praxis wenig verbreitet, erforderte er bis zur Veröffentlichung eines einfachen Tools zur Umrechnung von H/u-Daten in t/N-Wertepaare (nach DESMET, 2005) noch iterative, computergestützte Simulationsschritte. Dieses Bewertungsverfahren wurde in der vorliegenden Arbeit zur sinnvollen Bemessung des Leistungspotentials der synthetisierten open tubular-Kapillaren eingesetzt. Das Ergebnis ist in hervorragendem Einklang mit theoretischen Berechnungen anderer Autoren, da durch das hier vorgestellte neue Sol-Gel-Verfahren für LCPhasensynthesen zum ersten Mal eine Möglichkeit zur reproduzierbaren Synthese dicker Schichten („thick film“) zur Verfügung steht. Für die kleinste Variante (10 μm ID) ist die kinetische Grenzleistung (die maximal erreichbare Leistung pro Analysenzeit unter Optimierung aller zur Verfügung stehenden Parameter) bereits höher als für die ebenfalls untersuchte, kommerzielle Referenzkapillare. Dies erfordert eine Durchführung am Drucklimit, welches instrumentell bedingt im vorliegenden Fall bei 350 bar lag. Die für diese Grundbedingung notwendige, variable Säulenlänge lässt sich im Falle von open tubular- (und ebenso für monolithische) Kapillaren aufgrund der Abwesenheit von Fritten sehr einfach realisieren. Das Problem unzureichender Retention sowie kaum realisierbar geringer Beladungskapazität bisheriger, präparativer Arbeiten zur open tubular-Synthese konnte durch das neue Verfahren reduziert werden. Die experimentelle Bestätigung kinetischer in silico-Optimierungsmodelle sowie die Entwicklung des benötigten Herstellverfahrens selbst stellt, zusammengefasst, den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn dieser kumulativen Dissertation dar.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Miniaturized HPLC-systems are still far away from being used every day as the vast majority of running methods involve 4.6 mm stainless steel housings. Modern research areas such as proteomics, single cell-analysis or clinical applications might, in the near future, accelerate the transition from academic research to the chromatography market. The most important advantage of downsizing column volume, as a consequence of any miniaturization approach, is the reduction of the injection volume needed, and therefore, a decrease in sample consumption. Consequently, in sample-limited applications, development towards miniaturized HPLC columns is just mandatory. Although it seems natural packing porous particles in smaller fused silica capillaries, monolithic in situ-syntheses, chips and open tubular-capillaries likewise can be considered as miniaturized LC systems. Despite some crucial distinctions, the latter represent the current stationary phase design in gas chromatography. For liquid chromatography, however, it has never become very popular in practice. As early as in the 1980’s, the theoretical framework for the assessment of open tubular column performance was developed. Unfortunately, preparative success could not keep up with it, due to a lack of efficient methods available for the deposition of a thick, homogeneous, covalently bonded and fully porous film at the inner wall of capillaries. Preparative publications in the 1990’s offered promising plate counts, but the suitability for daily use was strongly constrained due to low retention or loadability of the columns obtained. Additionally, serious instrument limitations at that time emerged when handling nL/min-flow rates, coupled with detectability issues because of very small peak volumes eluting from the capillaries (modern LC instruments nowadays are very much more suitable). By transferring the concept of the well-studied sol-gel-synthesis of silica monoliths (NAKANISHIprocess) on confined spaces like 10-20 μm ID-capillaries, a new static preparation protocol for the preparation of open tubulars could be developed. The physical background for this process implies the anomaly of the combination of phase separation and sol-gel-transition when it comes to confined structures as a reaction vessel. Instead of a three dimensional, coral-like and spatially undirected morphology of the resulting monolithic material (which would be generated in bulk medium), a layer is deposited alongside the containing surface. When this containing surface is the inner wall of a long (fused silica) capillary, the resulting, approximately 500 nm thick porous layer can be employed as a stationary phase in HPLC. Diameter-dependency of this effect could be shown by means of syntheses in 50, 20, 15 and 10 μm ID-variants. Qualitative, structural properties such as layer thickness and its visual homogeneity were investigated by scanning electron microscopy of capillary cross-sections. Specific surface and mesoporosity were examined indirectly with the aid of nitrogen sorption experiments in bulk material of the same sol composition (approx. 200 m²/g and approx. 10 nm mean pore size diameter). Resulting silica capillaries were employed as chromatographic columns for the separation of test mixtures and simple application examples of small molecules (approx. 100-500 g/mol) were developed in normal and reversed phase mode. The latter were established by a subsequent surface modification process (octadecylsilane) without endcapping by use of a monofunctional aminosilane reagent. Satisfying retention factors in reversed phase gradient mode were obtained in a (non-baseline-) separation of a mixture of 32 pesticides. Creation of a VAN DEEMTER-plot for the 15 μm ID-variant resulted in a Hmin-value of 18 μm for propylbenzene. Regarding such a performance assessment by means of plate count per meter, open tubular capillaries are not able to compete in general as this method is strongly biased due to the negligence of column permeability. In comparison to both a particle packed and a monolithic commercial capillary (acting as reference columns), open tubulars from this work came up with a 600-fold decrease in flow resistance. Thus, only an alternative efficiency evaluation in terms of kinetic performance limitation (KPL)-plots, under consideration of column permeability, allowed for a truly fair comparison of column efficiency, as all tested capillaries are employed under optimized conditions, respectively. It involved a plot of the minimal analysis time, which is needed for the creation of a required plate count (kinetic plots). This approach is not very much prevalent throughout practical chromatographers as it required some iterative, such computer-based simulations for the creation of these plots. But in 2005, the DESMET group published a quite easy-to-use tool for the transformation of experimental H/u-data into t/N-pair of values. By doing so, the maximum column efficiency potential of the prepared open tubulars in this work was assessed and compared to the reference columns. The result is very much in line with what was predicted theoretically by other authors to be the expected efficiency gain of these columns. By use of the sol-gel-process in confined spaces developed herein for the creation of LC stationary phases, a new method for the reproducible deposition of silica thick films is available. For the smallest variant (10 μm ID), the theoretical kinetic performance limit (maximal performance at the end of a given analysis time under optimized conditions) is already superior compared to the monolithic reference column. One important requirement for this is the utilization of the column at the (user set) pressure limit, which was 350 bar in this work. Fulfilling this requirement demands for a variable column length, which could be easily implemented by just cutting the open tubular capillary (no frits required) to the desired length (also possible for monolithic capillary formats). The central issue of deficient retention and hardy feasible loadability of previous, preparative methods for open tubular syntheses could be addressed beneficially by the new manufacturing protocol. Experimental confirmation of kinetic in silico optimization models in terms of column efficiency as well as the development of the involved synthesis procedure itself represent the main scientific gain of the work in hand. English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
Date Deposited: 22 Jul 2014 06:10
Last Modified: 22 Jul 2014 06:10
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-38117
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Müller, PD Dr. Egbert
Refereed: 16 December 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3811
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