Therapeutische Antikörper finden eine breite Anwendung in klinischen Applikationen, Diagnostik sowie Forschung und Entwicklung. Diese Proteine werden u.a. in Säugetierzellen in Bioreaktoren produziert und müssen danach über Aufreinigungskaskaden im sogennanten „Downstream processing“ von anderen, unerwünschten Proteinen sowie Verunreinigungen getrennt werden. Typischerweise erfolgt zunächst eine Klärifizierung des Zellkulturüberstandes durch Zentrifugation und Filtration und danach eine Reihe von chromatographischen Schritten sowie weitere Filtrationen. Der initiale Chromatographieschritt ist hierbei üblicherweise eine Affinitätschromatographie, basierend z.B. auf Protein A oder G. Das Zielprotein bindet dabei an die Säulenmatrix, wobei unerwünschte Störproteine, sogenannte „host cell proteins“, abgetrennt werden können. Dieser Schritt beinhaltet eine Elution des gebundenen Zielproteins durch pH-Erniedrigung und kann mit einem Virusinaktivierungsschritt verknüpft werden. Danach folgen typischerweise Ionenaustauschchromatographie, z.B. Kationenaustauschchromatographie zur Abreicherung von Antikörperaggregaten, sowie hydrophobe Interaktionschromatographie. Nach einer finalen Filtration und zusätzlichen Virusinaktivierung kann das gereinigte Protein als „Drug Substance“ Verwendung finden. Bei diesem Herstellungsprozess wurden in den letzten Jahrzehnten erhebliche Fortschritte erzielt, was zu Steigerungen bei der Ausbeute geführt hat. Die höheren Volumenausbeuten haben jedoch gleichzeitig zu einer Verlagerung des Engpasses bei der Produktion weg vom Upstream, hin zum Downstream Bereich geführt. Dieser Engpass findet sich also nun in der Aufreinigung. Herkömmliche Chromatographie-basierte Systeme stoßen hierbei an ihre Kapazitätsgrenzen. Zusätzlich kann z.B. der Elutionsschritt bei der Affinitätschromatographie in der Aufreinigungskaskade unerwünschte Aggregate erzeugen. Diese Aspekte sowie steigender wirtschaftlicher Druck auf die Hersteller verlangen die Entwicklung alternativer nicht Chromatographie-basierter Aufreinigungsverfahren, um diesen Problemen - zumindest teilweise- entgegenzuwirken. Möglichkeiten hierfür sind z.B. größere Chromatographiesäulen, eine größere Kapazität der Säulenmaterialien, Wegwerfsäulen oder gezielte Fällung der Proteine in Batch-Verfahren.

Beispiele für diese Fällung sind die Fällung von Immunglobulinen mit Caprylsäure, das Aussalzen mittels Ammoniumsulfat sowie die Fällung mit Polyethylenglykol (PEG). Die Verwendung dieser Fällungsmittel hat jedoch einige Nachteile. Einige dieser Präzipitantien müssen in größeren Konzentrationen eingesetzt werden und führen dadurch zu größeren Abfallmengen, andere erfordern bestimmte Mindestkonzentrationen der zu fällenden Proteine. Daher sind Polyelektrolyte als Kopolymere in den wissenschaftlichen Fokus gelangt. Diese erlauben eine gerichtete Anpassung an die biophysikalischen Eigenschaften des Zielproteins, indem neben dissoziierbaren Gruppen (Eigenschaft der Polyelektrolyte) auch Gruppen mit ausgeprägten hydrophoben bzw. hydrophilen Eigenschaften ins Kopolymer eingefügt werden. Diese „mixed-mode“ Eigenschaften ermöglichen eine selektivere Präzipitation des Zielproteins, als dies durch Polymere mit rein elektrostatischen bzw. rein hydrophoben Wechselwirkungen möglich wäre (siehe Journalbeiträge [4] und [6]). Die Verwendung dieser Kopolymere soll u.a. dazu dienen, den initialen Affinitätschromatographieschritt zu ersetzen. Durch direkte Zugabe der Kopolymere in die klärifizierte Fermentationsbrühe kann in einem Batch-Verfahren eine selektive bzw. semi-selektive Fällung des Zielproteins erreicht werden. Nach Präzipitation und Rücklösung des Zielproteins in einem definierten Volumen kann zusätzlich eine Aufkonzentrierung erzielt werden und weitere folgende Chromatographieschritte teilweise ersetzt bzw. deren Kapazität erhöht werden. Dies kann idealerweise Aufreinigungsdauer und Aufwand verringern und gleichzeitig Ausbeute, Lebensdauer von Säulenmaterialien sowie Reinheit des Zielproteins erhöhen.

Dafür müssen solche Kopolymere jedoch speziellen Anforderungen genügen wie: (a) geringe Herstellungskosten; (b) hohe Selektivität und Ausbeute bei der Fällung; (c) einfache Anpassung an jeweilige Zielproteine; (d) gute Rückgewinnung bzw. Abtrennung vom Präzipitat; (e) sinnvollerweise geringere oder vergleichbare Kosten im Bezug zu etablierten Aufreinigungs-verfahren.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Kopolymere neu synthetisiert und für die spezifischen Anforderungen der Proteinaufreinigung untersucht. Durch systematische Variation der Kopolymerzusammensetzung gelang es, einen optimierten Präzipitationsprozess zu etablieren, welcher auch als Patentanmeldung eingereicht wurde. Die mit diesem Prozess assoziierten Kosten wurden hierbei mit Protein A Affinitätschromatographie verglichen und zeigten die Wirtschaft-lichkeit der Präzipitation gegenüber Chromatographie ab einem bestimmten Antikörpertiter in der Produktion (Journalbeitrag [4]). Parallel zur Entwicklung eines Kopolymer-basierten Protein-aufreinigungsverfahrens wurden grundlegende Mechanismen der Kopolymer- Protein- Interaktion untersucht, auch um die Selektivität und Ausbeute zu verbessern und ein tiefergehendes Verständnis der Präzipitation zu schaffen (Journalbeiträge [3] und [7]).

Die Abhängigkeit der Präzipitation von physiko-chemischen Eigenschaften der zu fällenden Proteine an Hand eines eingeführten binären Proteintestsystems war Gegenstand weiterer Untersuchungen (Journalbeitrag [6]). Als analytische Methode zur Untersuchung des Präzipitationsprozesses wurde die Infrarotspektroskopie eingesetzt [Journalbeiträge [1], [2], [4], [5], [7], Buchkapitel [8]). Sie erlaubte nicht nur eine Aussage über die Zusammensetzung der verwendeten Kopolymere sondern auch über die Präzipitationsausbeute und Selektivität der Fällung. Dabei wurden in einem at-line Verfahren der Titer des zu präzipitierenden Antikörpers, die Bildung von Aggregaten sowie der Gehalt an unerwünschten „host cell proteins“ bestimmt. Zusätzlich zur Nutzung der IR im speziellen Rahmen der Präzipitationsprozessentwicklung konnte gezeigt werden, dass diese Technik auch im Allgemeinen für die Quantifizierung kritischer Prozessparameter bei der Proteinaufreinigung Nutzung finden kann. Diese kritischen Prozessparameter beinhalten neben den oben genannten Parametern z.B. auch Endotoxine und exakte Konzentration an Antikörperaggregaten. Spezielle Anwendungsbeispiele dazu wurden in Publikationen und einer Patentanmeldung beschrieben (Journalbeiträge [1], [2] und [5]).