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Studien zur Reparatur Camptothecin- und Methylmethansulfonat-induzierter DNA-Schäden

Ebel, Christian :
Studien zur Reparatur Camptothecin- und Methylmethansulfonat-induzierter DNA-Schäden.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Studien zur Reparatur Camptothecin- und Methylmethansulfonat-induzierter DNA-Schäden
Language: German
Abstract:

Die Agenzien Camptothecin (CPT) und Methylmethansulfonat (MMS) werden aufgrund ihrer DNA-schädigenden Wirkung seit vielen Jahren untersucht. Vor allem in proliferierenden Zellen konnte dabei eine verstärkte Induktion von DNA-Schäden beobachtet werden, was zum Einsatz dieser Agenzien als Chemotherapeutika zur Behandlung von Krebserkrankungen führte. CPT ist ein Inhibitor, welcher eine Topoisomerase-katalysierte Religation von Einzelstrangbrüchen (SSBs) verhindert, wohingegen MMS ein Alkylanz ist, welches Basenmethylierungen an diversen Stellen im Genom verursacht. Basenmethylierungen werden durch den Mechanismus der Basenexzisionsreparatur behoben, wobei ebenfalls temporär SSBs entstehen. Die Wirkung von CPT und MMS wird auf eine massive Ausbildung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) in der S-Phase des Zellzyklus zurückgeführt, welche durch die Interferenz aktiver Replikationsgabeln mit SSBs induziert werden. Da DSBs den schwerwiegendsten Schaden für die genomische Integrität einer Zelle darstellen, haben sich Mechanismen entwickelt, welche DSBs effizient reparieren können. In der S-Phase wird die Reparatur jedoch durch die gleichzeitige Replikation der DNA verkompliziert. Außerdem können während der Replikation ein-endige DSB-Strukturen entstehen, welche sich von zwei-endigen DSBs unterscheiden. Die Reparatur von zwei-endigen DSBs, welche zum Beispiel durch ionisierende Strahlung verursacht werden können, ist vergleichsweise gut erforscht. So wird der Großteil dieser zwei-endigen DSBs in der G1- und G2-Phase des Zellzyklus durch die Nichthomologe-Endverknüpfung (NHEJ) bewerkstelligt, wobei in der G2-Phase zusätzlich die Homologe Rekombination (HR) einen Teil der DSBs repariert. Die HR bedient sich dabei bereits replizierter DNA als Vorlage zur Reparatur des geschädigten Bereichs auf dem Schwesterchromatid. Obwohl in der S-Phase je nach Fortschritt der Replikation womöglich keine Kopie eines geschädigten DNA-Bereichs vorliegt, konnte in den letzten Jahren beobachtet werden, dass die HR gerade für die Reparatur replikationsassoziierter DNA-Schäden eine große Rolle spielt. So ist es nicht verwunderlich, dass HR-defiziente Zellen besonders sensitiv auf Behandlungen mit MMS oder CPT reagieren, welche gezielt die Replikation von Zellen stören und in der S-Phase zu ein-endigen DSBs führen. HR-defiziente Zellen zeigen ein vermindertes Überleben und erhöhte chromosomale Aberrationen nach einer CPT- oder MMS-Behandlungen. Die molekularen Mechanismen sowohl der Entstehung von CPT- und MMS- induzierten DSBs als auch der Reparatur sind bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt. Die vorliegende Arbeit konnte mittels sensibler und zellzyklusspezifischer Analysen zunächst die Entstehung von CPT- und MMS-induzierten DSBs auf Einzelzellebene durch die Bildung von γH2AX-Foci in der S-Phase nachweisen. Desweiteren konnte eine HR-abhängige Reparatur der CPT- und MMS-induzierten DSBs bestätigt werden, wobei im Gegensatz zu beschriebenen Studien eine Beteiligung des NHEJs ausgeschlossen werden konnte. Anhand der Analyse von Schwesterchromatidaustauschen (SCEs) sowohl in humanen als auch Basenexzisionsreparatur (BER) -defekten, murinen Zellen konnte gezeigt werden, dass CPT und MMS während der Replikation DNA-Strukturen erzeugen, welche γH2AX-negativ sind und dennoch zur Ausbildung von SCEs führen. Diese Strukturen werden wahrscheinlich durch arretierte Replikationsgabeln hervorgerufen, welche durch CPT und MMS vermehrt induziert werden und so zu einer fork regression und Ausbildung von chicken foot-Strukturen führen können. Die Auflösung dieser Strukturen benötigt HR-Prozesse und kann ohne die Ausbildung von γH2AX-Foci zu crossover-Ereignissen und SCEs führen. Durch den innovativen Ansatz der kombinierten Life cell/γH2AX-Foci-Analyse konnte beobachtet werden, dass CPT DSBs in Abhängigkeit von der Aufenthaltsdauer von Zellen in der S-Phase induziert. Hieraus konnte geschlussfolgert werden, dass die Anzahl an induzierten DSBs direkt mit der Replikationsaktivität einer Zelle zusammenhängt und deshalb die in zellzyklusspezifischen Experimenten beobachtete Varianz der Anzahl an induzierten DSBs von Zellen stammt, welche unterschiedlich lange unter dem Einfluss von S-Phase-schädigenden Agenzien in der S-Phase standen. Mit durchflusszytometrischen Studien konnte das Zellzyklusverhalten von CPT- und MMS-behandelten Zellen analysiert werden, wobei festgestellt wurde, dass sowohl CPT als auch MMS zu einer Verzögerung der S-Phase-Progression und Akkumulation von Zellen mit doppeltem DNA-Gehalt führen. Dies resultierte in einer verminderten Progression von behandelten Zellen in die G1-Phase. Wurden zelluläre Checkpoint-Signale bereits innerhalb der S-Phase durch eine zusätzliche Koffein-Behandlung aufgehoben, so zeigten CPT-behandelte Zellen eine Beschleunigung der Progression, wohingegen MMS-behandelte Zellen nicht durch die Gabe von Koffein in Ihrer Progression beeinflusst wurden. Dies ließ im Fall von MMS auf einen Checkpoint-unabhängigen Mechanismus schließen, welcher Zellen in der S-Phase verlangsamt. Obwohl CPT und MMS in der Literatur als starke Klastogene beschrieben wurden, konnten in mitotischen Zellen, die zuvor in der S-Phase unter dem Einfluss von CPT oder MMS standen, weder erhöhte γH2AX-Foci-Level noch erhöhte Chromatidbruchraten detektiert werden. Selbst unter Suppression des essentiellen HR-Faktors RAD51 konnten vergleichsweise wenige induzierte γH2AX-Foci oder Chromatidbrüche in CPT- oder MMS-behandelten Zellen festgestellt werden. Erst durch eine zusätzliche Aufhebung des G2/M-Checkpoints konnte bei einer RAD51-Defizienz eine massive Klastogenität der beiden Agenzien in mitotischen Zellen beobachtet werden, sodass davon ausgegangen werden kann, dass Zellen höchst-effektive Mechanismen entwickelt haben, um replikationsassoziierte DNA-Schäden noch vor der Progression in die Mitose zu reparieren oder falls dies nicht möglich ist, eine Progression mit DSBs in die Mitose zu unterbinden. Womöglich können Zellen auf replika-tionsabhängige DNA-Schäden wesentlich besser reagieren als auf DNA-Schäden in der G1- oder G2-Phase, da die S-Phase den größten Quell endogener DNA-Schäden darstellt. Um herauszufinden, wann CPT- und MMS-induzierte DNA-Schäden repariert werden, wurden in der vorliegenden Arbeit neben den zytogenetischen Studien mitotischer Zellen zusätzlich Analysen von frühzeitig kondensierten Chromosomen der G2-Phase (G2-PCCs) durchgeführt. Die Ergebnisse ließen zusammen mit den Zellzyklusanalysen und den Life cell-Studien auf eine RAD51-vermittelte Arretierung von CPT- oder MMS-geschädigten Zellen in einer späten S-Phase schließen, da RAD51-profiziente Zellen keine erhöhten Chromatidbruchlevel in der G2-Phase aufwiesen. Mit einer RAD51-Defizienz hingegen progressierten Zellen mit unreparierten DSBs in die G2-Phase, wo sie mittels der PCC-Analyse in Form von Chromatidbrüchen detektiert werden konnten. Zusammenfassend weisen die in der vorliegenden Arbeit erlangten Ergebnisse auf eine Funktion von RAD51 in einer Checkpoint-unabhängigen Arretierung von CPT- oder MMS-behandelten Zellen zu einem späten Zeitpunkt der S-Phase hin. Dabei konnte gezeigt werden, dass RAD51 die Progression von Zellen mit CPT- oder MMS-induzierten DSBs in die G2-Phase verhindert. Ohne RAD51 progressieren Zellen mit erhöhten DSB-Raten in die G2-Phase, jedoch nicht in die Mitose, da der G2/M-Checkpoint die Progression geschädigter Zellen verhindert. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass sowohl CPT als auch MMS Strukturen erzeugen, welche nicht zur Ausbildung von „freien“ DSBs und damit zu γH2AX-Foci führen, allerdings HR-vermittelt aufgelöst werden und zur Entstehung von SCEs beitragen. Außerdem induziert MMS im Gegensatz zu CPT eine massive Anzahl an Methylierungen, welche zusätzlich zu einer Checkpoint-unabhängigen Verzögerung der S-Phase-Progression führen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
On account of their DNA-damaging effects, Camtpothecin (CPT) and Methyl methansulfonate (MMS) have been under investigation during the past decades. Due to the strong induction of DNA-damage in proliferating cells, CPT and MMS have become important chemotherapeutic drugs. CPT unfolds its toxicity by inhibiting a topoisomerase-catalyzed religation of single strand breaks (SSBs), whereas MMS causes methylated DNA-bases throughout the genome. These methylations are usually removed by the mechanism of base excision repair (BER), which causes transient SSBs as well. SSBs can lead to double strand breaks (DSBs) when replication forks encounter SSBs during S-Phase. Since DSBs are known to be the most severe lesions of DNA, cells have developed ingenious repair mechanisms to prevent genomic instability. Repair of DNA-damage during the S-Phase of the cell-cycle becomes complicated because replication-induced DSBs form one-ended DSBs which must be repaired by mechanisms other than two-ended DSBs. Two-ended DSBs can be induced by several endogenous processes as well as ionizing radiation for example. The repair of two-ended DSBs is carried out by two key repair pathways: Nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). While HR is limited to the S- and G2-Phase, due to the dependency on a sister chromatid as a template, NHEJ accomplishes the repair of all DSBs in G1-Phase and almost 80% of DSBs in the G2-Phase, despite HR being available in the G2-Phase. Interestingly, one-ended DSBs are preferentially repaired by HR. Thus HR-deficient cells are particularly sensitive to CPT and MMS, which cause SSBs that are converted to one-ended DSBs when cells undergo replication. However, the molecular mechanisms of the induction and repair of CPT- or MMS-induced DSBs are still unclear. In this study CPT- and MMS-induced DSBs were analyzed by cell cycle specific approaches. First of all, an induction of DSBs was observed within the S-Phase of CPT or MMS treated cells by γH2AX-foci-analysis. Next, a dependency of CPT and MMS induced DSBs on HR could be confirmed, whereas SiRNA-experiments excluded an involvement of NHEJ. By analyzing sister chromatid exchanges (SCEs) in human A549 cells and murine BER defective cells, it was shown that CPT and MMS cause DNA-structures which lead to SCEs but not to γH2AX-foci. These structures may display stalled replication forks which contribute to the formation of chicken foot structures by the mechanism of fork regression. The dissolution of reversed replication forks may lead to the formation of SCEs without forming any γH2AX-foci. Using cutting edge life cell microscopy combined with γH2AX-foci analysis it was possible to track the induction of DSBs induced by CPT within the S-Phase. This attempt revealed that the amount of CPT-induced DSBs is strictly bound to the time cells spend in S-phase and replication activity. Regarding cell cycle specific analysis of damaged S-phase cells a variety in the number of CPT or MMS induced DSBs could be observed especially at later time points after treatment, which is due to the different amount of DSBs cells acquired during replication. Flow cytometry allowed an analysis of the cell cycle behavior of CPT and MMS treated cells. CPT and MMS caused a slowed S-phase progression and an accumulation of cells with doubled DNA content, which resulted in a reduced G1-Phase progression. The inhibition of intra S-Phase checkpoints by caffeine led to an accelerated S-Phase progression and an abolished slowing effect of CPT. On the contrary, MMS treated cells expressed no response to caffeine and still showed a slowed S-Phase progression. Thus, MMS induced a delay independent of S-phase checkpoints, whereas the CPT-induced slowing was checkpoint dependent. CPT and MMS have been described as clastogenic reagents. Against expectation neither γH2AX-foci nor chromatid breaks could be observed in mitotic cells after treatment with CPT or MMS. Even in the absence of RAD51, an essential factor of HR, no γH2AX-foci or chromatid breaks were detected after CPT or MMS treatment. It was not until the inhibition of the G2/M checkpoint by caffeine that massive clastogenic effects were observed in CPT and MMS treated RAD51 deficient cells. This demonstrates the effective and strong mechanisms that cells have developed during evolution to hinder replication associated lesions from progression to mitosis. This could be explained by the mechanisms that cells have developed to handle endogenously induced DNA-damage best, which mainly occurs in S-phase. To investigate when CPT and MMS induced DSBs are repaired, studies with prematurely condensed chromosomes were carried out. Together with the results of cell cycle and Life cell studies, the G2-PCC technique revealed a RAD51-dependent arrest of CPT and MMS treated cells within the S-Phase, since no chromatid breaks could be observed in RAD51 proficient G2-Phase cells in contrast to RAD51 deficient cells. Overall this study shows a function of RAD51 that leads to a checkpoint independent arrest of CPT and MMS treated cells at a late stage of S-Phase. Although CPT and MMS treated cells finish the bulk of replication before repairing replication associated DSBs, they do not enter mitosis with elevated DSB levels. By analyzing prematurely condensed G2-chromosomes it can be shown that CPT and MMS treated cells do not even enter G2-Phase with unrepaired DSBs. Without RAD51, cells progress into G2-Phase with high levels of unrepaired DSBs, however they do not enter mitosis unless the G2/M checkpoint is aborted. In addition, this work shows the existence of a mechanism that leads to the formation of CPT and MMS induced SCEs without the necessity of "free" DSBs but rather the presence of chicken foot structures. Furthermore MMS induces a checkpoint independent slowing of S-Phase progression which could be explained by the massive induction of methylations that physically block replication. English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 10 Oct 2013 06:09
Last Modified: 10 Oct 2013 06:09
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-36327
Referees: Löbrich, Prof. Markus and Thiel, Prof. Gerhard
Refereed: 6 September 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3632
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