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The outer transmembrane domain of the Kesv channel determines its intracellular localization

Guthmann, Thomas :
The outer transmembrane domain of the Kesv channel determines its intracellular localization.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: The outer transmembrane domain of the Kesv channel determines its intracellular localization
Language: English
Abstract:

The two viral potassium channels Kcv from Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 and Kesv from Ectocarpus siliculosus Virus 1 are structurally very similar with a high degree of sequence identity. Despite these structural similarities, the two channels reveal, when expressed in mammalian HEK293 cells, a fundamentally different sorting: Kcv is located in the plasma membrane, while Kesv is in the inner membrane of mitochondria. Previous experiments have shown that the second transmembrane domain (TMD2) of Kesv contains a sorting signal. An elongation of this domain by >1 hydrophobic amino acids was able to redirect sorting of Kesv from the mitochondria to the secretory pathway and finally to the plasma membrane. The present thesis addresses the question on the molecular nature of this sorting signal in TMD2. To do this in an unbiased manner randomized mutants of the critical domain within TMD2 of Kesv were generated with a randomized site directed mutagenesis PCR. In combination with a yeast complementation assay, where only yeast mutants with a functional potassium channel in the plasma membrane can survive, two Kesv mutants could be identified. These channel mutants are no longer located in the mitochondria but in the plasma membrane. The results of these experiments show that an elongation of TMD2 in Kesv is not mandatory for this redirection of sorting. A bioinformatic analysis of the amino acid exchanges in the mutants implies that a shift in sorting is generated by amino acids, which lower the local energy for the transfer of the TMD2 into a membrane. To further verify the sorting of the two Kesv mutants into the plasma membrane, confocal laser scanning microscopy was employed. For a confidential localization it was necessary to optimize a method in which an isolated plasma membrane patch from mammalian cells is adhered with a poly-D-lysin coat to a glass surface. After removing the cell body by an osmotic shock and after further washing steps, which only leaves bare membrane patches, the fluorescent signal of GFP tagged channel proteins can be detected in these patches. In this assay it is possible to detect known plasma membrane channels such as Kat1 or Kcv and the two Kesv mutants. Kesv, which is sorted to mitochondria, is not seen in these patches. The results of these experiments underline the data from the yeast complementation assay in that the sorting mutants of Kesv are indeed localized in the plasma membrane. This interpretation was further underscored by single molecule studies. It occurred that the isolation of the membrane patches is in combination with TIRF microscopy suitable for high-resolution imaging on the level of single molecules. The signal to background ratio is very low because of the very low excitation volume of the flat membrane patch and the absence of signals from the cell body. Also with this technique it was possible to localize both the two Kesv mutants and the reference channels Kat1 and Kcv in the plasma membrane. The mobility of the proteins confirms that they are not peripheral but inserted into the membrane.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die beiden viralen Kaliumkanäle Kcv aus dem Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 und Kesv aus dem Ectocarpus siliculosus Virus 1 sind sich strukturell sehr ähnlich mit einem hohen Grad an Gemeinsamkeit in ihrer Aminosäuresequenz. Trotz dieser strukturellen Gemeinsamkeiten zeigen beide Kanäle, wenn sie in HEK293 Zellen exprimiert werden, eine grundverschiedene Sortierung: Kcv ist in der Plasmamembran lokalisiert, während Kesv sich in der inneren Mitochondrienmembran befindet. Vorausgegangene Studien haben gezeigt, dass die zweite Transmembrandomäne von Kesv ein Sortierungssignal enthält. Eine Verlängerung dieser Domäne um mehr als eine hydrophobe Aminosäure reichte aus, um die Sortierung von Kesv von den Mitochondrien in den sekretorischen Weg umzuleiten, bis letztendlich zur Plasmamembran. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage der molekularen Natur dieser Signalsequenz in der zweiten Transmembrandomäne. Um dies auf eine unvoreingenommene Art und Weise zu machen wurden randomisiert Mutanten der betreffenden Region in der zweiten Transmembrandomäne von Kesv mit Hilfe einer randomized site directed mutagenesis PCR hergestellt. In Kombination mit einem Hefekomplementationstest, bei dem nur Hefemutanten mit einem funktionalen Kaliumkanal in der Plasmamembran überleben, konnten zwei Kesv Mutanten gefunden werden. Diese Kesv Mutanten sind nicht länger in den Mitochondrien lokalisiert dafür aber in der Plasmamembran. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass eine Verlängerung der zweiten Transmembrandomäne von Kesv nicht zwingend notwendig ist, um eine Veränderung in der Kanalsortierung zu erzeugen. Bioinformatische Analysen des Aminosäureaustausches zeigten, dass vermutlich die Veränderung der Sortierung durch Aminosäuren verursacht wird, welche die lokale Energie für den Transfer der zweiten Transmembrandomäne in die Membran herabsetzen. Um weiter die Sortierung der beiden Kesv Mutanten in die Plasmamembran zu bestätigen wurde die confocal laser scanning Mikroskopie verwendet. Für eine vertrauenswürdige Aussage war es nötig, eine bestehende Methode zur Isolierung der Plasmamembran aus Säugetierzellen zu optimieren, bei der ein Membranfleck auf poly-D-Lysin beschichteten Deckgläsern haftet. Nach der Entfernung des Zellkörpers mittels eines osmotischen Schocks und etlichen Waschschritten, welche einen flachen Membranfleck offenbaren, konnte das GFP Fluoreszenzsignal von Proteinen in diesen Membranflecken detektiert werden. Mit diesem Versuchsaufbau ist es möglich bekannte Plasmamembrankanäle wie Kat1 oder Kcv und die zwei Kesv Mutanten zu detektieren. Der Wildtyp vom Kesv, welcher in den Mitochondrien lokalisiert ist, kann in diesen Membranflecken nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung untermauern die Ergebnisse des Hefekomplementationstests, bei dem die Kesv Mutanten in der Plasmamembran lokalisiert sind. Diese Interpretation wird weiterhin durch Einzelmoleküluntersuchungen gestützt. Es zeigte sich, dass die Kombination der Isolierung von Membranflecken mit TIRF Mikroskopie sich gut eignet für hochaufgelöste Mikroskopie auf Einzelmolekülniveau. Das Signal zu Hintergrundrauschverhältnis ist sehr gering durch das geringe Anregungsvolumen des flachen Membranfleckens und des Fehlens von Signal des restlichen Zellkörpers. Auch mit dieser Technik war es möglich beide Kesv Mutanten und die Referenzkanäle Kat1 und Kcv in der Plasmamembran nachzuweisen. Die Mobilität der Proteine bestätigt, dass sie sich in der Membran befinden.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Plant Membrane Biophysics
Date Deposited: 18 Jul 2013 08:11
Last Modified: 18 Jul 2013 08:11
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-35208
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed: 4 July 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3520
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