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Apoptosis, as a special form of programmed cell death (PCD) is an essential developmental process that is involved in tissue homeostasis and, whose deregulation has severe pathological implications for an organism. Thus, the evasion of the apoptotic program is one hallmark capability of cancer cells. Tumor suppressor genes (TSG) under normal conditions fulfill functions like sensing DNA-damage or regulating gene expression and they may contribute to the induction of apoptosis. In most cancer cells, TSG are mutated, inactivated or their expression level is reduced to enable neoplastic outgrowth and tumor cell proliferation. Furthermore, inactivation or blockage of TSG function may contribute to activation and upregulation of anti-apoptotic oncogenes. The identification and functional characterization of novel pro-apoptotic proteins, which can act as tumor suppressors themselves, is important in cancer research.
In this study, the novel APAF-1 binding protein FAM96A, which was discovered in a yeast two hybrid screen, was functionally characterized, and its involvement in tumorigenesis and Fe-S cluster biogenesis was elucidated. Importantly, the endogenous interaction with monomeric APAF-1 was confirmed.
Furthermore, FAM96A has recently been described to interact with the cytosolic iron sulfur assembly protein Ciao1. A combined functional contribution of Ciao1 and FAM96A to intrinsic apoptosis was excluded by overexpression and knockdown experiments during this study. Ciao1 exhibits a rather anti-apoptotic function, which is independent of FAM96A and, most probably, connected to its role in cytosolic Fe-S biogenesis. However, a scaffolding function of FAM96A during cytosolic iron-sulfur assembly might reflect a conserved function of the protein.
Ciao1 was described to regulate the transcriptional activity of WT1, a tumor suppressor in childhood nephroblastoma. Here, a reduction of WT1 mRNA expression upon simultaneous Ciao1 overexpression was observed, whereas the contribution of FAM96A to the regulation of the WT1 transcription factor was only minor.
The role of FAM96A in intrinsic apoptosis was investigated by stable lentiviral protein overexpression in cancer cells. Human colon carcinoma and murine renal cancer cells were transduced to upregulate their FAM96A levels. These stable cell lines were compared to control vector transduced cells in apoptosis assays investigating the effects of FAM96A overexpression on the intrinsic pathway. Upon induction of PCD by the chemotherapeutic agents mitomycin C and the second-generation platinum derivative oxaliplatin, cell killing was enhanced when FAM96A was simultaneously upregulated. Accordingly, when protein levels were diminished as a consequence of lentiviral short hairpin RNA (shRNA)-mediated knockdown, a significant desensitization of murine fibroblast and RKO cells to the induction of the intrinsic apoptosis pathway was observed. Furthermore, the influence of increased FAM96A expression levels was investigated in vivo in subcutaneous tumor xenograft experiments in NOD/SCID mice. The engraftment potential of colon cancer cells was drastically impaired in FAM96A groups compared to controls, and tumor growth was reduced in RKO as well as Renca-lacZ tumors. While a regulatory influence of FAM96A on intrinsic apoptosis could be observed, the cell cycle distribution of Renca-lacZ was not affected by FAM96A upregulation.
Although several approaches were taken to elucidate the molecular mechanism of the pro-apoptotic contribution of FAM96A to intrinsic apoptosis and its putative function during apoptosome assembly, it remains unresolved until now. A potential scaffolding function of FAM96A during apoptosome assembly or an involvement as a nucleotide exchange factor on APAF-1 cannot be excluded. As a pro-apoptotic protein, FAM96A resembles a putative tumor-suppressor gene, and losses within the FAM96A locus were detected by comparative genomic hybridization. Here, copy number aberrations were observed most prominently in gastrointestinal stromal tumors (GIST) where 48.8% of tumors analyzed indicated deletions. This was further addressed by immunohistochemistry of 53 GIST patient samples, and independent of cancer origin, no positive staining for FAM96A could be observed. A second patient cohort of GISTs of distinct grading was analyzed for FAM96A mRNA expression, which was reduced in 29 out of 31 samples. Upon re-introduction of FAM96A in established GIST cell lines, susceptibility towards apoptotic treatment with the state-of-the-art tyrosine kinase inhibitor Imatinib Mesylate and, in the case of imatinib-resistant GIST, staurosporine was increased compared to controls. Tumorigenicity of GIST882 cells re-expressing FAM96A was significantly reduced in a tumor xenograft experiment, and the engraftment potential was diminished. Quantitative real time PCR analysis on the time point of FAM96A loss in the course of tumorigenesis indicate that reduction of FAM96A mRNA levels may occur as an oncogenic event during malignant transformation of interstitial cells of Cajal, the suspected cell of origin of GIST. FAM96A therefore represents a marker for GIST and a novel tumor suppressor protein in this cancer entity. Nonetheless, FAM96A exhibits its tumor-suppressive potential not only in GIST, but also in further tumor entities as suggested by multi-tumor tissue arrays. Protein levels were reduced in renal and transitional cell carcinoma compared to normal kidney and bladder tissue.
The physiological function of the protein was further investigated by the establishment and preliminary analysis of a conditional FAM96A knockout mouse model. Here, FAM96A/lacZ reporter mice were generated in which Exon 3 of the FAM96A gene was deleted following breeding of mice with CMV-Cre mice. Strong endogenous FAM96A promoter activity was observed in tissues of the immune system such as spleen and thymus, and in the gastrointestinal tract of the FAM96A-/- mice. Surprisingly, and in contrast to observations from yeast, drosophila and zebrafish model systems, where knockout of the gene was lethal, FAM96A-/- mice were born and vital and displayed no obvious phenotype under non-stressed conditions.
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Apoptose als eine Sonderform des programmierten Zelltods ist ein konservierter, entwicklungsphysiologisch relevanter Prozess, der zur Gewährleistung der Gewebshomöostase wesentlich beiträgt. Eine Fehlregulation des apoptotischen Zelltods hat schwerwiegende pathologische Implikationen und ist zum Beispiel wesentlich für die Krebsentstehung und neurodegenerative Erkrankungen mit verantwortlich. Sowohl inaktivierende Mutationen in pro-apoptotischen Genen als auch die Aktivierung anti-apoptotischer Onkogene tragen zur Ausbildung von Neoplasien bei. In nicht-kanzerogenen Zellen regulieren Sensorproteine, sogenannte Tumorsuppressoren, physiologische Abläufe wie den Zellzyklus, die Apoptose oder sind für die Zelldifferenzierung verantwortlich. Die Identifizierung und Charakterisierung neuer, potentieller Tumorsuppressorgene (TSG) stellt darum einen wichtigen Inhalt der aktuellen Krebsforschung dar.
In dieser Arbeit wurde das in einem Hefe-2-Hybridsystem isolierte APAF-1-bindende Protein FAM96A als Tumorsuppressor charakterisiert und seine pro-apoptotische Rolle im intrinsischen Apoptoseweg näher definiert. Zunächst wurde die Interaktion der im Hefe-2-Hybridsystem isolierten Partner APAF-1 und FAM96A mit den endogenen Bindungspartnern in HEK293T Zellen verifiziert. Preliminäre Daten von transienten Überexpressionsexperimenten und zur APAF-1-Interaktion des Proteins lieferten einen Hinweis auf eine pro-apoptotische Funktion und sollten bestätigt werden. Um eine weitere, funktionelle Charakterisierung des Proteins zu ermöglichen, wurden stabile Zelllinien zur FAM96A-Überexpression generiert und auf ihr Apoptoseverhalten hin mit Kontrollvektor-transduzierten Zellen verglichen. Diese Überexpressionsstudien wurden sowohl in humanen Kolonkarzinomzellen (RKO) als auch in einer murinen Nierenkrebszelllinie (Renca-lacZ) durchgeführt, und der intrinsische Zelltod wurde mit Hilfe von Chemotherapeutika wie Mitomycin C oder Oxaliplatin induziert. Hierbei konnte die pro-apoptotische Funktion des Proteins bestätigt werden. Dieser stimulatorische Einfluss des Proteins auf den mitochondrialen Apoptoseweg wurde durch FAM96A-Deletionsanalysen mit Hilfe von „short hairpin“ RNAs in murinen Fibroblasten und RKO-Zellen verifiziert. Ein signifikanter Desensitisierungseffekt gegenüber UV-induzierter Apoptose als Resultat der verringerten FAM96A-Proteinexpression konnte hier im Vergleich zu Kontrollvektor-transduzierten Zellen festgestellt werden.
Mit Hilfe subkutaner Tumorxenograftexperimente in immunkompromittierten NOD/SCID Mäusen wurde die in vivo Relevanz dieser Beobachtungen näher eruiert. Ein stark verringertes Tumorwachstum gegenüber der Kontrollgruppe konnte in den Gruppen mit gesteigerter FAM96A-Expression nachgewiesen werden. Desweitern ließ sich ein signifikant inhibitorischer Einfluss der Überexpression auf das Anwachsen der RKO-Tumoren feststellen. Insgesamt konnte eine suppressive Rolle von FAM96A auf das Wachstum und Anwachsen von Tumoren im Tiermodell nachgewiesen werden. Ein Einfluss der Überexpression von FAM96A auf die Zellzyklusverteilung von Renca-lacZ Zellen konnte nicht beobachtet werden. Um die potentielle Tumorsuppressorfunktion des pro-apoptotischen Zelltodregulators FAM96A näher zu charakterisieren wurde in silico in einer CGH (comparative genomic hybridization) Datenbank nach chromosomalen Aberrationen des Genlokus in einer Vielzahl von Tumorentitäten recherchiert. Deletionen im FAM96A Lokus konnten in 48,8% der Fälle für gastrointestinale Stromatumoren (GIST) nachgewiesen werden. Diese Beobachtung wurde mit Biopsien von zwei unabhängigen Patientenkohorten bestätigt. Zunächst wurden 31 Tumorproben mit Hilfe quantitativer real time PCR auf ihre FAM96A mRNA-Mengen analysiert, und in 29 von 31 untersuchten Tumoren konnte ein verringertes FAM96A-Expressionsniveau im Vergleich zu normalem Ileum beobachtet werden. Die deutlich reduzierte FAM96A-Expression verhielt sich unabhängig von der Tumorklassifizierung (Grading). In einer zweiten Patientenanalyse wurden 53 GIST-Proben immunhistochemisch auf ihre FAM96A-Proteinexpression hin untersucht. Hier ließ sich für keine der 53 Proben aus verschiedenen Regionen des humanen Verdauungsapparates eine positive FAM96A-Färbung im Vergleich zur Positivkontrolle Lebergewebe nachweisen. Der Verlust der FAM96A-Expression im Laufe der Entstehung von GIST aus Cajalzellen stellt somit einen molekularen Marker für diese Tumorentität dar. Möglicherweise wird die Reduktion der FAM96A mRNA-Expression bereits während der malignen Transformation im Laufe der GIST Onkongenese initiiert. Mittels real time PCR-Analysen wurde in transformierten GIST-Vorläuferzellen ein geringeres FAM96A-Level als bei wildtyp-Cajalzellen festgestellt. Desweiteren wurde der Einfluss einer FAM96A Re-expression in etablierten GIST-Zelllinien untersucht. Hierfür wurden sowohl Imatinib-resistente GIST48, als auch Imatinib-sensitive GIST882 Zellen lentiviral transduziert und der Einfluss von Kinaseinhibitor-vermittelter Apoptose in FAM96A re-exprimierenden Zellen ermittelt. Eine erhöhte FAM96A-Expression in beiden Zelllinien führte zu einer gesteigerten Suszeptibilität gegenüber der Kinaseinhibition durch Imatinib. Auch im Tumorxenograftmodell konnte in GIST sowohl ein statistisch signifikant reduziertes Tumorwachstum als auch eine verringerte Anzahl angewachsener Tumoren nach FAM96A Re-expression beobachtet werden. Die potentielle Tumorsuppressor Funktion des pro-apoptotischen Proteins konnte somit in GIST bestätigt werden. FAM96A wirkt aller Wahrscheinlichkeit nach nicht nur in GIST als Tumorsuppressor, denn es konnte ein signifikant verringertes Proteinexpressionslevel immunhistochemisch in Nierenzellkarzinomen und Urothel-zellkarzinomen nachgewiesen werden. Die Charakterisierung der tumor-suppressiven Funktion von FAM96A in diesen Entitäten stellt einen Fokus aktueller Untersuchungen dar.
Desweiteren wird eine Funktion des Proteins bei der Eisen-Schwefelcluster-biosynthese angenommen, die durch die beschriebene Interaktion von FAM96A mit Ciao1 nahegelegt wird. Ciao1 wiederum stellt einen essentiellen Regulator der zytosolischen Eisen-Schwefelclusterbiosynthese (CIA) dar und ist für die Beladung von Fe-S-Apoproteinen maßgeblich verantwortlich. Zunächst wurde die Interaktion von überexprimiertem FAM96A mit endogenem Ciao1 in HEK293T Zellen verifiziert und ein potentieller gemeinsamer Einfluss der beiden Interaktionspartner auf die Apoptoseregulation untersucht. Nach Überexpressions- und Deletionsanalysen von Ciao1 konnte ein antagonistischer, anti-apoptotischer Effekt des CIA-Proteins nachgewiesen werden. Dieser ist voraussichtlich auf die Beteiligung des Proteins bei der Fe-S-Biosynthese zurückzuführen. Viele Fe-S-Proteine sind in wichtige Stoffwechselprozesse und DNA-Reparaturmechanismen involviert. So wirkt sich ein gesteigertes Ciao1-Expressionslevel vermutlich positiv auf die Beladung zytosolischer Fe-S-Apoproteine mit ihrer prosthetischen Gruppe aus.
Eine weitere interessante und publizierte Funktion von Ciao1 ist die Regulation der Transkriptionsfaktoraktivität von WT1. Die beschriebene inhibitorische Wirkung von Ciao1 auf die Aktivität von WT1 wurde in Luciferase-Reporteranalysen in der AG Zörnig nicht bestätigt. Ciao1 trug zu einer signifikanten Steigerung der Fireflyluciferase-Expression durch WT1-vermittelte Aktivität des Amphiregulin-promoters bei. Daraufhin sollte der gemeinsame Einfluss von Ciao1 und FAM96A auf WT1-Zielgene analysiert werden. Da das WT1-Protein seine eigene Promoteraktivität reguliert, wurde die WT1 mRNA-Expression mit Hilfe von quantitativer real time PCR nach Transfektion von Ciao1 und FAM96A untersucht. Hier konnte eine deutliche Reduktion der WT1 mRNA nach simultaner Überexpression von Ciao1 nachgewiesen werden. Die Rolle von FAM96A bei der Regulation der WT1-mRNA-Expression kann, den durchgeführten Experimenten zufolge, als vernachlässigbar eingestuft werden. Ciao1 fungiert möglicherweise zur Feinjustierung der WT1-Aktivität, indem es den Transkriptionsfaktor bindet und dieser seine autosuppressive Funktion am eigenen Promoter nicht mehr effizient ausüben kann und somit die Aktivität von WT1 über Ciao1 gesteigert wird.
Zur weiteren Analyse der physiologischen Funktion von FAM96A wurde in dieser Arbeit ein konditionales FAM96A Knockout-Mausmodell etabliert und preliminär analysiert. Durch Cre-vermittelte Rekombination wurde Exon 3 des FAM96A Gens deletiert. Das verbleibende Transkript unterliegt der Genfallenmutagenese und wird durch das Vorkommen eines Splice-Akzeptors in der Selektionskassette hinter Exon 2 posttranskriptional trunkiert. Die inserierte Genkassette enthält neben einem Polyadenylierungssignal am 3´ Ende ein lacZ-Reporterelement. Die lacZ-Expression spiegelt die Promoteraktivität des FAM96A Promoters wider und kann durch X-Gal-Färbung in murinen Organen nachgewiesen werden. Eine starke Aktivität des FAM96A Promoters konnte in Organen des Immunsystems wie etwa Thymus und Milz beobachtet werden. Weiterhin war eine signifikante Färbung im Ileum der homozygoten FAM96A-/--Tiere nachzuweisen. In vorangehenden Analysen wirkte sich das Ausschalten von FAM96A im Zebrafisch, der Fruchtfliege und der Hefe embryonal lethal auf die Organismen aus. Überraschenderweise scheint die Deletion von FAM96A in der Maus jedoch nicht zu einem embryonal-lethalen Phänotyp zu führen und die Tiere zeigen kein auffälliges Erscheinungsbild im ungestressten Zustand. Dies könnte auf eine mögliche funktionelle Redundanz zwischen FAM96A und seinem Homolog FAM96B hinweisen. | German |
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