Rhiel, Laura (2013)
Nicht-kovalente Oberflächenpräsentation von Antikörpern auf Hefezellen.
Technische Universität Darmstadt
Ph.D. Thesis, Primary publication
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Text
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Item Type: | Ph.D. Thesis | ||||
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Type of entry: | Primary publication | ||||
Title: | Nicht-kovalente Oberflächenpräsentation von Antikörpern auf Hefezellen | ||||
Language: | German | ||||
Referees: | Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Neumann, Prof. Dr. Siegfried | ||||
Date: | 2013 | ||||
Place of Publication: | Darmstadt | ||||
Date of oral examination: | 11 December 2012 | ||||
Abstract: | Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Prüfung eines Verfahrens zur nicht-kovalenten Präsentation von Antikörpern, Antikörper-abgeleiteten Molekülen sowie darauf basierenden Molekülbibliotheken auf der Oberfläche von Hefezellen als Technologie im Prozess der pharmazeutischen Wirkstofffindung. Die nicht-kovalente Oberflächenpräsentation ermöglicht die Selektion von spezifischen Molekülvarianten mittels Hochdurchsatz-Durchmusterung sowie die nachfolgende Induktions-gesteuerte Sekretion des selektierten Bindemoleküls in den Kulturüberstand zur Produktion und biochemischen Charakterisierung ohne Wirtswechsel. Im Mittelpunkt steht die erfolgreiche Kombination von Selektion und Produktion mit dem zeitsparenden Verzicht auf Subklonierungen und Reformatierungsschritte, die bei vergleichbaren Methoden nötig sind. Dadurch kommt es zu einer enormen Vereinfachung und Beschleunigung von sich anschließenden Prozessschritten der Wirkstofffindung. Durch die Verwendung einer Fc-Bindedomäne als Vermittlermolekül der nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation von IgG-Molekülen und Fc-Fusionsproteinen ist es möglich, selektiv zwischen Oberflächenpräsentation und Sekretion in das Kulturmedium zu schalten. Erreicht wird das durch einen induzierbaren Expressionsmodus, wodurch leicht zwischen Membran-gebundener und löslicher Expression geschaltet werden kann. Der Vorteil dieses Verfahrens ist das einheitliche und finale Proteinformat während Präsentation, Selektion und löslicher Charakterisierung und die dadurch gewährleistete Reproduzierbarkeit von Proteineigenschaften in diesen Prozessschritten. Die Kernfrage der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Verifizierung der Genotyp/Phänotyp-Kopplung zwischen präsentierter Proteinvariante und genetischer Information in der Zelle, da durch die nicht-kovalente Oberflächenpräsentation nicht per se von einer stabilen Kopplung ausgegangen werden konnte. Zu diesem Zweck wurden erfolgreich verschiedene Mischungsexperimente durchgeführt. Des weiteren wurden verschiedene VHH-Bibliotheken mit in vitro und in vivo Diversifizierungstechniken erstellt und charakterisiert und diese unter Verwendung des nicht-kovalenten Verfahrens nach Varianten mit gewünschten Eigenschaften mittels magnetisch- und Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (MACS und FACS) durchmustert. |
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Alternative Abstract: |
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URN: | urn:nbn:de:tuda-tuprints-32710 | ||||
Classification DDC: | 500 Science and mathematics > 540 Chemistry | ||||
Divisions: | 07 Department of Chemistry | ||||
Date Deposited: | 20 Feb 2013 10:53 | ||||
Last Modified: | 09 Jul 2020 00:16 | ||||
URI: | https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3271 | ||||
PPN: | 386298882 | ||||
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