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Kernweite H2AX-Phosphorylierung nach Schwerionenbestrahlung

Meyer, Barbara :
Kernweite H2AX-Phosphorylierung nach Schwerionenbestrahlung.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Kernweite H2AX-Phosphorylierung nach Schwerionenbestrahlung
Language: German
Abstract:

Schwerionenstrahlen verursachen in der Zelle in Abhängigkeit von ihrer Energie lokalisierte, komplexe DNA-Schäden, die eine besondere Herausforderung für die Reparaturmechanismen der Zelle darstellen. Das Histon H2AX fördert die Reparatur von DNA-Schäden durch Akkumulation von Reparaturfaktoren in der Nähe der DNA-Schäden. Hierzu wird H2AX im Megabasenpaarbereich um DNA-Doppelstrangbrüche an Serin 139 phosphoryliert, wodurch γH2AX gebildet wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach Induktion komplexer DNA-Schäden durch Schwerionenbestrahlung zusätzlich ein spezifisches, jedoch schwächeres γH2AX-Signal über den gesamten Zellkern verteilt entsteht. Dieser Prozess ist in humanen und murinen Zellen, sowie in Hamsterzellen konserviert und findet sowohl in normalen Fibroblasten als auch in Tumorzellen statt. Bei pan-nukleärem γH2AX handelt es sich nicht um aus dem Chromatin ausgetauschtes Histon, sondern H2AX wird auch im nicht beschädigten Bereich phosphoryliert, wobei dieser Prozess sowohl in der G1- als auch in der G2-Phase stattfindet. Ein möglicher Zusammenhang mit Apoptose, bei der ebenfalls eine kernweite H2AX-Phosphorylierung induziert wird, konnte durch zellmorphologische Untersuchungen, sowie Analyse mit Apoptosemarkern ausgeschlossen werden. Zur genaueren Charakterisierung der kernweiten Antwort wurde γH2AX mittels Immunfluoreszenzmikroskopie quantifiziert, wodurch eine Unterscheidung zwischen dem γH2AX-Signal an den DNA-Schäden und dem kernweiten γH2AX-Signal möglich war und die Signale der γH2AX-Foci zu einem großen Teil aus der Messung ausgeschlossen werden konnten. Dabei wurde die genaue Bestrahlung durch die Mikrosonde angewendet, die eine gezielte Lokalisierung einer definierten Anzahl an Ionen innerhalb des Zellkerns ermöglicht. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die kernweite Antwort nur nach Bestrahlung der Zellkerne, nicht aber des Cytoplasmas ausgelöst wird. Desweiteren nimmt die kernweite H2AX-Phosphorylierung eindeutig mit steigender Dosis zu, wobei γH2AX bei höheren Dosen langsamer ansteigt. Schon nach Bestrahlung mit einzelnen Kohlenstoffionen (ca. 0,2 Gy) wird diese Antwort induziert und ist bis zu einer Dosis von ca. 70 Gy nach Bestrahlung mit mehreren Goldionen nicht gesättigt, so dass γH2AX an den Foci immer noch stärker war als im unbeschädigten Bereich des Zellkerns. Es ist also keine Schwellendosis nötig, um diese Antwort auszulösen, so dass es möglich erscheint, dass dieser Prozess auch bei locker ionisierender Bestrahlung in geringem Umfang stattfinden könnte. Die Verteilung der Ionentreffer innerhalb des Zellkerns hatte keinen Einfluss auf die H2AX-Phosphorylierung. Die Untersuchung der kernweiten Antwort über die Zeit ergab, dass bereits eine Stunde nach Bestrahlung eine Rückbildung von kernweitem γH2AX beginnt und γH2AX wenige Stunden nach Bestrahlung auf einem niedrigen Niveau verbleibt. Interessanterweise ist die Rückbildung des pan-nukleären Signals unabhängig vom verwendeten Ion und der applizierten Dosis, während die Rückbildung der γH2AX-Foci eine langsamere Kinetik insbesondere nach höherem LET aufweist, da DNA-Schäden mit zunehmender Komplexität eine längere Reparaturzeit benötigen. Dies deutet darauf hin, dass die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen keine Voraussetzung für die Rückbildung von pan-nukleärem γH2AX ist. Es wurde eindeutig unter Verwendung von spezifischen Inhibitoren und defizienten Zellen gezeigt, dass die kernweite H2AX-Phosphorylierung von ATM und DNA-PK katalysiert wird, da die kernweite H2AX-Phosphorylierung erst durch Unterdrückung beider Kinasen vollständig inhibiert wurde. Bei Aktivität nur einer der beiden Kinasen wird die kernweite Antwort induziert, ist jedoch meist abgeschwächt. Der Verlust einer Kinase kann also nicht vollständig durch die andere Kinase kompensiert werden. ATM scheint bei einer Dosis von unter 10 Gy bereits vollständig aktiviert zu sein, während sich für DNA-PK abzeichnete, dass die Menge der aktivierten Kinase LET-abhängig ist und auch bei hohen Dosen bis 50 Gy noch weiter ansteigen kann. Dies könnte dazu führen, dass DNA-PK bei höheren Dosen eine immer stärkere Rolle im Vergleich zu ATM einnimmt. Es sind verschiedene Mechanismen vorstellbar, wie die kernweite H2AX-Phosphorylierung ausgelöst werden könnte. Es wird beschrieben, dass durch Bestrahlung Chromatinstrukturveränderungen über Acetylierung von Histonen induziert werden. Nach Schwerionenbestrahlung könnte eine globale acetylierungsabhängige Veränderung der Chromatinstruktur eine kernweite Kinase-Aktivierung bewirken. Daher wurde der Einfluss der Inhibition von Histondeacetylasen oder Acetyltransferasen auf die kernweite Antwort untersucht. Acetylierung war jedoch nicht nötig, um die kernweite Antwort zu induzieren und Hyperacetylierung löste die kernweite Antwort nicht aus, verstärkte diese jedoch nach Schwerionenbestrahlung, was mit einer verbesserten Zugänglichkeit von H2AX in Zusammenhang stehen könnte. Eine pan-nukleäre H2AX-Phosphorylierung kann auch beim Einbringen von DNA-Fragmenten in die Zelle ausgelöst werden, wodurch vor allem DNA-PK aktiviert wird. Nach Schwerionenbestrahlung entstehen DNA-Brüche in enger räumlicher Nähe zueinander, so dass DNA-Fragmente direkt oder auch durch Nuklease-Aktivität gefördert entstehen könnten. Um einen möglichen Einfluss von Nukleasen auf die kernweite H2AX-Phosphorylierung zu überprüfen, wurde die Expression von CtIP und Mre11 herunterreguliert. Beide Nukleasen scheinen jedoch nicht zu einer Verstärkung der kernweiten Antwort beizutragen, stattdessen scheint Mre11 die kernweite Antwort eher zu verringern. Dabei ist jedoch noch unklar, über welchen Mechanismus Mre11 diesen Effekt bewirken könnte. Desweiteren wäre es möglich, dass ATM und DNA-PK am DNA-Schaden aktiviert werden und von dort in aktiver Form für kurze Zeit durch den Zellkern diffundieren können. Allerdings ist eine Diffusion von DNA-PK in aktiver Form vom DNA-Ende weg bisher nicht beschrieben. Die genaue Ursache für die kernweite Antwort bleibt daher zunächst offen. Da γH2AX an DNA-Doppelstrangbrüchen die Akkumulation von Reparaturfaktoren fördert, wurde ein möglicher Einfluss von kernweitem γH2AX auf andere Reparaturkomponenten untersucht. Wie in der Nähe des DNA-Schadens besteht kernweit eine gegenseitige Abhängigkeit von γH2AX und MDC1, einem Mediatorprotein, das an DNA-Doppelstrangbrüchen die verstärkte Akkumulation von ATM und die Rekrutierung von 53BP1 vermittelt. Es wurde gezeigt, dass MDC1 an pan-nukleäres γH2AX bindet und dabei die Phosphorylierung von weiterem H2AX durch ATM und DNA-PK verstärkt. Die MDC1-Bindung am DNA-Schaden scheint dabei deutlich vermindert zu sein. 53BP1 hingegen bindet fest in der Nähe des DNA-Schadens, es konnte jedoch keine kernweite Bindung nachgewiesen werden, was darauf schließen lässt, dass pan-nukleär weitere für die 53BP1-Bindung nötige Signale fehlen. Die phosphorylierten Formen anderer Zielproteine von ATM und DNA-PK wie NBS1 und RPA zeigten kein starkes kernweites Signal. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die kernweite H2AX-Phosphorylierung die meisten Reparaturkomponenten und in diesem Zusammenhang wahrscheinlich die biologische Wirksamkeit von Schwerionenstrahlen nicht stark beeinflusst. Die Untersuchungen in dieser Arbeit liefern neue Einblicke in die Auswirkungen von Schwerionenbestrahlung auf molekularer Ebene und beschreiben eine neuartige kernweite Reaktion der Zelle auf die Induktion lokaler komplexer DNA-Schäden. Weitere Untersuchungen sind jedoch nötig, um diese Antwort vollständig zu verstehen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Heavy ion radiation generates, dependent on its energy localized complex DNA lesions that are particularly challenging for the cellular DNA repair mechanisms. The histone H2AX promotes the repair of DNA damage through the accumulation of repair factors at the sites of DNA damage. For this purpose H2AX is phosphorylated on serine 139 in a megabasepair region around the double strand break, forming γH2AX. In this thesis it is demonstrated that after induction of complex DNA damage by heavy ion irradiation additionally a specific, although weaker γH2AX signal forms throughout the whole cell nucleus. This process is conserved in human, murine and hamster cells and occurs in normal fibroblasts as well as in tumor cells. The pan-nuclear γH2AX does not arise by an exchange from chromatin; H2AX is phosphorylated also in the undamaged area of the chromatin in both G1 and G2 phase of the cell cycle. A possible connection to apoptosis, that also leads to a nuclear-wide phosphorylation of H2AX, could be excluded by morphological analysis of cells and labeling with apoptotic markers. To characterize the pan-nuclear response in detail, γH2AX was quantified by immunofluorescence microscopy which allows to discriminate between the pan-nuclear signal and γH2AX accumulated at DNA damage sites forming foci that could largely be excluded from the evaluation. Precise irradiation with the heavy ion microbeam was used to allow the aimed targeting of cell nuclei with a defined number of ions. The analysis showed that the nuclear-wide response is only induced after irradiation of the cell nucleus, but not after irradiation of the cytoplasm. Furthermore the nuclearwide phosphorylation of H2AX increases clearly with dose but more slowly at higher doses. This response is initiated already after irradiation with single carbon ions (ca. 0,2 Gy) and does not reach saturation up to around 70 Gy following irradiation with multiple gold ions. Even here γH2AX was still stronger at the foci than in the undamaged area of the nucleus. There seems to be no threshold dose to induce this response, such that this process might also occur at a low level after sparsely ionizing radiation. The distribution of the ion hits within the cell nucleus had no influence on the H2AX phosphorylation. Analysis of the nuclear-wide response over time demonstrated that a decrease of nuclear-wide γH2AX starts already one hour after irradiation and only a low level of γH2AX remains a few hours after irradiation. Interestingly, the decrease of the pan-nuclear signal is independent of the ion used and the applied dose, whereas the decrease of γH2AX foci follows a slower kinetics especially after the induction of DNA damage with increasing complexity that needs more time to be repaired. This suggests that the repair of DNA double strand breaks is not a prerequisite for the decrease of pan-nuclear γH2AX. Using specific inhibitors and deficient cell lines it could be shown clearly that the nuclear-wide phosphorylation of H2AX is catalyzed by ATM and DNA-PK, as the pan-nuclear response could only be suppressed completely by inhibition of both kinases. With only one kinase active the nuclear-wide response was still induced but mostly weaker. Thus the kinases could not compensate each other to full extent. ATM seems to be completely activated already at a dose of under 10 Gy whereas a LET dependency was apparent for the amount of activated DNA-PK that could be further increased up to 50 Gy. This could lead to a predominant role of DNA-PK at higher doses. The nuclear-wide phosphorylation of H2AX could be initiated by different mechanisms. It has been described that irradiation may induce changes of chromatin structure by acetylation of histones. After heavy ion irradiation a potential global acetylation-dependent change of chromatin structure could provoke the nuclear-wide kinase activity. Therefore the influence of the inhibition of histone deacetylases and acetyltransferases on the nuclear-wide response was analysed. However, acetylation was not necessary to induce the pan-nuclear signal and also hyperacetylation did not initiate the nuclear-wide response, but rather increased it after heavy ion irradiation. This might be connected to an improved accessibility of H2AX. A pan-nuclear H2AX phosphorylation can also be initiated by introducing DNA fragments into cells, which leads primarily to DNA-PK activation. After heavy ion irradiation DNA breaks are produced in close proximity to each other which could lead to the production of DNA fragments either directly or promoted by nuclease-dependent DNA processing. To analyse a possible influence of nucleases on the pan-nuclear H2AX phosphorylation the expression of CtIP and Mre11 was suppressed. None of the nucleases seemed to be necessary for the induction of the nuclear-wide response, instead the pan-nuclear signal appeared to be higher in the absence of Mre11, although the mechanism is not yet clear. Alternatively, it would be possible that ATM and DNA-PK become activated at DNA damage sites and diffuse from the DNA ends in their activated form through the nucleus. However, a diffusion of activated DNA-PK from the DNA end has not been described so far. Thus the exact cause for the pan-nuclear response remains open. Since at DNA double strand breaks γH2AX promotes the accumulation of repair factors, a possible influence of nuclear-wide γH2AX on other repair components was examined. Similar to DNA damage foci, a mutual interdependence between γH2AX and MDC1, a mediator protein that promotes the increased accumulation of ATM and the 53BP1 recruitment at double strand breaks, occurs also nuclear-wide. It is shown that MDC1 binds to pan-nuclear γH2AX and increases the phosphorylation of H2AX by ATM and DNA-PK. The binding of MDC1 at the DNA damage sites seems to be diminished by the pan-nuclear response. 53BP1 on the other hand binds strongly in proximity to the DNA damage but a nuclear-wide binding could not be detected, indicating that further signals needed for the recruitment of 53BP1 are missing in the undamaged chromatin. The phosphorylated forms of other protein targets of ATM and DNA-PK, like NBS1 and RPA, did not display a clear pan-nuclear signal. These results do not support a general influence of the pan-nuclear H2AX phosphorylation on the damage response proteins and in this context it does probably not affect the biological effectiveness of heavy ion radiation. The investigations in this thesis describe a novel nuclear-wide reaction of the cell to the induction of localized, complex DNA lesions and thus provide new nsights into the impact of heavy ion irradiation on the molecular level. However, further analyses are needed for a complete understanding of this response.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 16 May 2012 07:05
Last Modified: 07 Dec 2012 12:04
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-29828
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Durante, Prof. Marco and Löbrich, Prof. Markus
Refereed: 27 March 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2982
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