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Selektion von Lassa Fieber Virus spezifischen single chain Fv Antikörperfragmenten aus einer Immun-Antikörperbibliothek mittels Phage Display

Karpenko, Nataliya :
Selektion von Lassa Fieber Virus spezifischen single chain Fv Antikörperfragmenten aus einer Immun-Antikörperbibliothek mittels Phage Display.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Selektion von Lassa Fieber Virus spezifischen single chain Fv Antikörperfragmenten aus einer Immun-Antikörperbibliothek mittels Phage Display
Language: German
Abstract:

Durch die zunehmende Globalisierung, eine stark erhöhte individuelle Mobilität sowie durch eine Veränderung der Umwelt und des Lebensstils der Menschen in den letzten Jahrzehnten muss eine ganze Reihe von Infektionen als klinisch neue Erkrankungen definiert werden. Zu solchen Erregern gehört auch das in West Afrika endemische Lassa Fieber Virus (LASV), ein Vertreter der Gruppe der Negativ-Strang RNA Viren, welches ein schweres hämorrhagisches Fieber auslöst. Gegenwärtig existieren weder eine Prophylaxe, eine spezifische Therapie noch ein Impfstoff gegen das LASV. Zudem erfordern die Diagnostik sowie Erforschung von Lassa Viren besondere Schutzmaßnahmen und Vorkehrungen, da aufgrund der hohen Übertragungsrate von Mensch zu Mensch und der hohen Sterblichkeitsrate das Lassa Fieber Virus in die höchste biologische Sicherheitsstufe BSL-4 eingeordnet ist. Obwohl die protektive Wirkung Virus-neutralisierender Antikörper in unabhängigen Studien sowohl am Tiermodell und als auch mit infizierten Menschen mehrfach demonstriert wurde, stehen aktuell nur wenige nicht käufliche Antikörper gegen Lassa-virale Proteine zur Verfügung und über deren Entstehung, Eigenschaften sowie Kinetik bei der Kontrolle der Virämie ist kaum etwas bekannt. Deshalb sollte im Rahmen dieser Arbeit die humorale Antwort eines LASV-infizierten Patienten, welcher die Erkrankung überlebte, eingehenend analysiert werden. Ausgangspunkt dieser Arbeit war ein im Juli 2006 an hämorrhagischem Lassa Fieber erkrankter Patient aus Sierra Leone. Der Patient wurde erfolgreich mit Ribavirin therapiert. Während der nachfolgenden Untersuchungen im Zeitraum vom 2006 bis 2010 wurden insgesamt fünf Blutproben entnommen, welche hinsichtlich der Bindungs- sowie Neutralisationseigenschaften der Antikörper in verschiedenen Assays untersucht wurden. Es konnten in vier der fünf Serumproben sowohl bindende als auch neutralisierende Antikörper ermittelt werden. Ziel dieser Arbeit war es eine scFv-Immunbibliothek aus den B-Lymphozyten des Patienten, aus welcher über Biopanning Virus-spezifische scFv-Fragmente isoliert wurden, zu erstellen. Parallel wurde eine weitere naive Bibliothek HAL4/7 für die Selektion positiver scFs seitens der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Dübel (TU Braunschweig) zur Verfügung gestellt. Als Grundlage für eine Selektion dienten zum einen die mithilfe der Pseudotypisierung hergestellten, retroviralen heterologen LASV Partikel und zum anderen lösliche, mittels humaner Zellen exprimierte, virale Glykoproteine 1, welche in Kooperation mit Prof. Dr. S. Kunz am Institut de Microbiologie, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Lausanne, Schweiz) erzeugt wurden. Da pseudovirale Partikel das native Target darstellen, galt diesem Ansatz ein besonderes Interesse. Die Voraussetzung für eine erfolgreiche Selektion der spezifischen scFv war die Immobilisierung der viralen Partikel an geeignete Trägermoleküle. Im Laufe der Arbeit wurden verschiedene Methoden entwickelt und getestet. Am erfolgreichsten erwies sich dabei die Biotinylierung der Partikel mit anschließender Immobilisierung über Streptavidin. Nach der Etablierung der Immobilisierungsmethode für virale Partikel erfolgte das Screening der Immunbibliothek, wobei eine Anreicherung LASV spezifischer scFv stattfand. Durch die Selektion konnten vier positive Klone isoliert werden. Die Sequenzanalyse dieser Klone zeigte, dass es sich dabei um drei verschiedene Fragmente handelt, da zwei der vier scFv (D1 und D8) die gleiche Sequenz aufweisen. Interessant ist, dass das zweifach vorkommende Fragment eine verkürzte schwere Kette hat. Die identifizierten scFv wurden in E. coli exprimiert und die scFv-haltigen bakteriellen Überstände wurden nach der Aufreinigung auf Neutralisation von LASV getestet. Bei dem Neutralisationsassay zeigten zwei der drei Klone eine deutliche Verringerung der Infektion um ca. 40%. Bei der Selektion der naiven Bibliothek HAL4/7 konnten weitere Klone isoliert werden, deren Bindungskapazitäten jedoch relativ gering waren. Dennoch wurden die identifizierten scFv-Fagmente in Neutralisationstests eingesetzt, wobei sich zeigte, dass zwei von neun Klonen als eindeutig neutralisierend deklariert werden konnten. Eine anschließende Sequenzanalyse ergab jedoch nur eine Konsensussequenz, welche als C8/B5 Klon bezeichnet wurde. In Gegenüberstellung mit den Sequenzen der Klone aus der Immunbibliothek konnten keine Übereinstimmungen bzw. Homologien festgestellt werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein experimentell nicht angewandtes System etabliert werden, welches durch Verwendung geeigneter LASV Hüllproteintargets, sowie der Antikörper-Phagenbanken erlaubt, LASV-spezifische Antikörper zu selektieren. Somit können diese in Hinsicht auf ihren Ansatz für diagnostische und therapeutische Anwendungen analysiert werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The entrance of new or rare viruses into the human population requires the development or adaptation of diagnostic tests for these pathogens as well as an identification of new antigenic determinants. Furthermore, new therapeutic approaches are needed in case only a few drugs are available or resistant viruses have appeared. Virus entry inhibition represents an attractive target for therapeutic purposes, as inhibition at this early step would prevent the de novo infection of cells. The aim of this PhD thesis is to generate human monoclonal antibodies against Lassa Fever Virus for diagnostic or therapeutic purposes using the phage-display technique. Currently, there are neither licensed vaccines against Lassa Fever, nor experimental vaccines that have completely protected nonhuman primates against a lethal challenge. Such antibodies will be helpful for diagnostics and in case of neutralization for vaccination purposes. Lassa Fever Virus (LFV) is the causative agent of Lassa viral hemorrhagic fever and belongs to CDC Category A agents. The virus is a single stranded RNA virus belonging to the Arenaviridae. The surface of the virion is studded with glycoprotein (GP) complexes which are responsible for the LFV infection and thus are the principal target for virus neutralizing antibodies. This work was based on a patient from Sierra Leone infected with LASV. The patient was hospitalized at the University Clinics and treated with ribavirin. He survived the infection. This allowed us to obtain blood samples from the patient and to analyze the presence of LFV-specific antibodies in his plasma. Their presence would qualify the patient as suited for the derivation of antibody fragments from his B cells. The presence of LFV binding and neutralizing antibodies in the patient sera was analyzed. The titer of LFV binding antibodies was determined. The neutralizing activity was detected in the serum of the patient using pseudotyped Lassa Fever Viruses. Neutralizing antibody titers increased over time in the samples. The heavy and light chains from IgG genes were amplified by PCR from cDNA from patient´s lymphocytes and cloned into the phage vector pHAL 14 (in cooperation with the group of Prof. Stefan Dübel in Braunschweig). A single chain Fv library was generated to select LFV GP specific antibody fragments. The library was used for the selection of LFV specific scFv fragments using pseudotyped LFV in positive and Moloney Murine Leukemia virus (MLV) negative selections. Optimized conditions for the target immobilization were established for the screenings. The pseudotyped viruses were coated on magnetic beads or ELISA-plates via Biotin/Streptavidin binding. Furthermore in cooperation with the group of Prof. Dr. S. Kunz (Institut de Microbiologie, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Lausanne, Schweiz), a soluble LFV-Glycoprotein 1 was successfully expressed in mammalian cells, which was also used as a target for screenings. Additionally, the naive library pHAL4/7 was selected for binding and neutralizing antibodies. Three positive clones from the immune and one clone from the naïve library could be isolated. The corresponding scFv were expressed in E. coli for further characterization. Culture supernatants containing the scFv neutralized LFV entry by 40%. Thus, binding and neutralizing antibody fragments against LASV could be selected that have now to be further characterized in view of their potential application for diagnostic and therapeutic purposes.English
Uncontrolled Keywords: Lassa Fieber Virus, Antikörper
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Fachbereich Chemie
Date Deposited: 23 May 2012 13:34
Last Modified: 07 Dec 2012 12:04
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-29658
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Dencher, Prof. Dr. Nobert A.
Refereed: 24 October 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2965
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