Die SMAD-Signalübertragung ist entscheidend für die Regulierung wichtiger zellulärer Prozesse wie Differenzierung, Proliferation, Apoptose, Migration und Produktion extrazellulärer Matrix. Der Signalweg wird aktiviert, wenn Liganden der TGF-beta-Superfamilie an spezifische Serin/Threonin Kinaserezeptoren auf der Zelloberfläche binden und die Bildung von Rezeptorkomplexen induzieren, die SMAD-Proteine an ihren C-terminalen Domänen phosphorylieren. Die phosphorylierten SMADs bilden dann Oligome, die in den Zellkern wandern und die Genexpression regulieren. Trotz des umfangreichen Wissens über die Komponenten des TGF-beta-Signalwegs ist das Verständnis darüber, wie die Aktivierung des Signalwegs zu unterschiedlichen zellulären Reaktionen führt, insbesondere auf Einzelzellebene und bei verschiedenen Liganden, noch begrenzt. Um dieses Problem zu lösen, habe ich die Dynamik der SMAD-Signalübertragung mithilfe quantitativer, zeitaufgelöster Messungen von Fluoreszenzreportern und computergestützter Datenanalyse untersucht. Mit Hilfe von Live-Cell Imaging und Fluoreszenzreportersystemen untersuchte ich die Signaldynamik von SMAD2/3 und SMAD1/5/9 als Reaktion auf verschiedene Liganden und zelluläre Bedingungen, wobei ich mich auf ihre Rolle in Zellen des Brustdrüsenepithels und des Endothels konzentrierte. Diese Forschung zielt darauf ab, unser Verständnis der Mechanismen zu vertiefen, die der SMAD-Dynamik bei der Regulierung von Zellschicksalsentscheidungen zugrunde liegen. Unsere früheren Studien mit Liganden der TGF-beta-Superfamilie haben gezeigt, dass SMAD2 je nach Zellzustand unterschiedlich reagiert. TGF-beta löste in proliferierenden Zellen eine starke SMAD2- Reaktion aus, die in der Ruhephase abgeschwächt war. Im Gegensatz dazu löste Activin A konsistente SMAD2-Reaktionen in verschiedenen Zellstadien aus, und GDF11 führte zu gegensätzlichen Effekten - erhöhte SMAD2-Aktivität in ruhenden Zellen und abgeschwächte Reaktionen in proliferierenden Zellen. Interessanterweise gab es Hinweise darauf, dass die daraus resultierenden Entscheidungen über das Zellschicksal auf Einzelzellebene eher von der Intensität der SMAD-Signalisierung als von der Ligandenspezifität beeinflusst werden. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen beschäftigte sich der erste Teil meiner Forschung mit zwei Schlüsselfragen: Ist die Intensität der SMAD-Reaktion tatsächlich mit den Entscheidungen über das Zellschicksal bei verschiedenen Liganden der TGF-beta-Superfamilie korreliert? Und welche Mechanismen modulieren die SMAD-Antwort in verschiedenen Zellstadien in Gegenwart unterschiedlicher Liganden? Durch die Behandlung mit Activin A konnte ich zeigen, dass die Akkumulation von SMAD2 im Zellkern von MCF10A-Zellen stark mit dem zellulären Phänotyp korreliert, wobei der Zellzustand ein wichtigerer Faktor ist als der Ligandentyp. EGF wurde als entscheidender Modulator des SMAD2-Reaktionsnetzwerks identifiziert, der in der Lage ist, die Apoptose in ruhenden Zellen unabhängig vom Liganden zu retten. Darüber hinaus untersuchte ich die Rolle der Phosphorylierung in der SMAD2-Linker-Region für die stimulus- und zustandsspezifische Signalübertragung, indem ich Reporterzelllinien mit Mutationen der entsprechenden Phosphorylierungsstellen erzeugte. Bei der Untersuchung der Rolle von SMAD3 stellte ich fest, dass sein Knockout zu einer einheitlichen SMAD2-Kerntranslokation sowohl in proliferierenden als auch in ruhenden Zellen nach GDF11-Stimulation führte, aber das Reaktionsmuster auf TGF-beta nicht veränderte. Die Wiedereinführung von SMAD3 schwächte die SMAD2-Akkumulation als Reaktion auf GDF11 ab, wobei die Schwächungswerte mit der SMAD3-Expression korrelierten. Um tiefere Einblicke in die Faktoren zu gewinnen, die die zustands- und ligandspezifische SMAD-Signalgebung beeinflussen, habe ich die RNA-Sequenzierung genutzt, um Proteine zu identifizieren, die die durch GDF11 induzierte SMAD3-vermittelte SMAD2-Reaktion modulieren. Diese Analyse ergab, dass mehrere Gene durch den SMAD3-Signalweg reguliert werden. Aus diesen Beobachtungen schließe ich, dass ein extrazellulärer Rückkopplungsmechanismus, der von SMAD3 angetrieben wird, eine entscheidende Rolle bei der Modulation der SMAD2-Antwort spielen könnte, was neue Perspektiven für die dynamische Regulierung der SMAD-Signalübertragung in verschiedenen zellulären Kontexten eröffnet. Aufbauend auf den Erkenntnissen über die SMAD2/3-Signalübertragung in Epithelzellen habe ich den SMAD1/5/9-Signalweg in vaskulären Endothelzellen untersucht. Mein primäres Ziel war es, zu vergleichen, wie SMAD1, SMAD5 und SMAD9 auf verschiedene Liganden der TGF-beta Superfamilie reagieren, und dabei sowohl einzigartige als auch überlappende Aktivierungseffekte dieser Signalkomponenten aufzudecken. Darüber hinaus wollte ich untersuchen, wie sich das Gleichgewicht zwischen den SMAD1/5/9- und SMAD2/3-Signalwegen bei verschiedenen Liganden verschiebt und die zellulären Reaktionen beeinflusst. Zu diesem Zweck entwickelte ich fluoreszierende Reporterzelllinien für SMAD1, SMAD5 und SMAD9 in EA.hy926-Gefäßendothelzellen und charakterisierte die Dynamik und Empfindlichkeit der Signalüberträger. Um zu verstehen, wie SMAD1/5/9 auf verschiedene Liganden der TGF-beta-Superfamilie reagieren, konzentrierte ich mich auf deren unterschiedliche und sich überschneidende Wirkungen. Meine Ergebnisse zeigten, dass nur BMP9 und BMP10 eine robuste Akkumulation von SMAD im Zellkern bewirken. Ich identifizierte FKBP12 als einen wichtigen Inhibitor der ALK2-vermittelten SMAD1/5/9-Aktivierung, der deren Aktivierung durch Liganden wie BMP7 und Activin A einschränkt. Bemerkenswert ist, dass diese Liganden in Abwesenheit von FKBP12 sowohl den SMAD2/3- als auch den SMAD1/5/9-Weg aktivieren. Mit einem dualen SMAD1-SMAD2-Reportersystem habe ich das Gleichgewicht zwischen SMAD1 und SMAD2 untersucht und verschiedene Rezeptorkomplexe identifiziert, die an der SMAD2/3-Aktivierung beteiligt sind: Die BMP7-induzierte Aktivierung beruht auf ALK4/ALK2- Heterodimeren, während die Activin A-induzierte Aktivierung sowohl ALK4/ALK2-Heterodimere als auch ALK4-Homodimere umfasst. Beide Liganden nutzen ALK2-Homodimere für die Aktivierung von SMAD1/5/9. Schließlich untersuchte ich die zellulären Reaktionen, die durch die Aktivierung von SMAD1/5/9 und/oder SMAD2/3 ausgelöst werden, und bestätigte eine kooperative Interaktion zwischen den SMAD1/5/9- und SMAD2/3-Wegen, wobei ich die Rolle von FKBP12 als Schlüsselregulator der SMAD1/5/9-Aktivität hervorhob. Insgesamt bieten diese Ergebnisse neue Einblicke in die Art und Weise, wie die SMAD-Dynamik die Leistung einzelner Zellen sowohl in Epithel- als auch in Endothelzellen beeinflusst. Insbesondere vermittelt SMAD3 die GDF11-induzierte SMAD2-Reaktion in MCF10A-Zellen in einer dosisabhängigen Weise, während FKBP12 eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der SMAD1/5/9-Reaktionen auf BMP7 und Activin A in EA.hy926-Zellen spielt. Diese Forschung klärt Schlüsselfaktoren auf, die an der Regulierung der SMAD-Signalübertragung als Reaktion auf verschiedene Ligandenstimuli beteiligt sind, und vertieft unser Verständnis ihrer Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen.