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Antagonisierung von Stress-Signalwegen durch das Amyloid Precursor Protein (APP): Untersuchungen zu den molekularen Mechanismen der APP-vermittelten Neuroprotektion

Chang, Steffi :
Antagonisierung von Stress-Signalwegen durch das Amyloid Precursor Protein (APP): Untersuchungen zu den molekularen Mechanismen der APP-vermittelten Neuroprotektion.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Antagonisierung von Stress-Signalwegen durch das Amyloid Precursor Protein (APP): Untersuchungen zu den molekularen Mechanismen der APP-vermittelten Neuroprotektion
Language: German
Abstract:

Bei der Entwicklung der Alzheimer Krankheit spielt das Amyloid-Precursor-Protein und seine proteolyische Spaltung eine zentrale Rolle. Die Prozessierung von APP resultiert im amyloidogenen Weg in der Bildung des neurotoxischen Aβ-Peptids und im nicht-amyloidogene Weg in der Produktion von sAPPα, welches vermutet wird in seiner Funktion diametral zu Aβ zu stehen. Demgemäß könnte neben der pathologischen Akkumulation von Aβ im Gehirn ebenso der Verlust der physiologischen Funktion von sAPPα zur Neurodegeneration und den kognitiven Defiziten bei Morbus Alzheimer führen. In der vorliegenden Arbeit wurden die biologischen Eigenschaften des neuroprotektiven Spaltproduktes sAPPα unter verschiedenen Alzheimer-relevanten Stressbedingungen untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Störung des Ubiquitin-Proteasom-Systems, welche eng in Zusammenhang mit zytotoxischem neuronalen Stress bei Morbus Alzheimer gebracht wird, durch Applikation eines potenten Proteasom-Inhibitors initiiert. Für die Untersuchung der Eigenschaften von sAPPα unter den gewählten Bedingungen wurden zum einen konditionierte Überstände von APP-überexprimierenden HEK-Zellen oder aufgereinigtes rekombinantes sAPPα aus verschiedenen Expressionssystemen verwendet. Eine Präinkubation mit sAPPα bewirkte einen Schutz vor Zelltod in PC12 Zellen, wie morphologische Untersuchungen der Fragmentierung der Zellkerne, der Aufnahme von Propidiumiodid und Analysen der Effektor-Caspase-Aktivität aufzeigten. Dieser potente Schutz in der PC12-Zelllininie konnte nur für sAPPα und nicht für sAPPβ, ein APP-Spaltprodukt das sich nur um 17 Aminosäuren unterscheidet, nachgewiesen werden. Das im zweiten Teil der Arbeit verwendete Schädigungsmodell der Störung der Kalziumhomöostase konnte durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Ca2+-ATPasen oder durch Behandlung mit NMDA realisiert werden. Die Störung des empfindlichen Kalziumhaushaltes stellt ein gemeinsames Merkmal für die Alterserscheinung des Gehirns und der Pathophysiologie von Morbus Alzheimer dar. In der vorliegenden Arbeit gelang es Apoptose, die durch die Störung der Kalziumhomöostase ausgelöst wurde, durch sAPPα potent zu verringern. Dieser protektive Effekt von sAPPα für PC12 Zellen konnte für hippocampale Neurone validiert werden. Für beide Schädigungsmodelle konnte der anti-apoptotische Effekt von sAPPα mit der Inhibition des Stress-responsiven JNK/c-Jun Signalweges und der Stimulation des anti-apoptotischen PI3K/Akt Signalweges assoziiert werden. Ein möglicher pharmakologisch, präventiver Ansatzpunkt in der Alzheimer Krankheit stellt die Einflussnahme auf die proteolytische Spaltung von APP dar. So könnte sich eine Stimulation der nicht-amyloidogenen Prozessierung, die in der Produktion des neuroprotektiven Bestandteils sAPPα resultiert, Aβ-induzierte neurotoxische Effekte ausgleichen. In der vorliegenden Arbeit konnte mittels Docosahexaensäure, einer Omega-3 Fettsäure, Einfluss auf die Membranfluidiät von APP überexprimierenden HEK Zellen genommen werden. Die erhöhte Membranfluidiät ließ sich mit einer gesteigerten Menge an sAPPα und somit einer erhöhten nicht-amyloidogenen Prozessierung korrelieren. Hieraus resultierend konnte eine Behandlung mit DHA eine Protektion vor Apoptose, die durch die Störung der Kalziumhomööstase induziert wurde, erzielen. Es konnte nachgewiesen werden, dass der protektive DHA-abhängige Effekt auf sAPPα zurückzuführen ist.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The Amyloid Precursor Protein (APP) and its metabolism play fundamental roles in the pathophysiology of Alzheimer's disease (AD). Processing of APP along the amyloidogenic pathway results in the generation of the neurotoxic Aβ peptide, while cleavage along the non-amyloidogenic pathway generates sAPPα, which is known to exhibit neuroprotective and neurotrophic properties. With regard to these diametral functions of APP cleavage products it is supposed that not only the pathological accumulation of Aβ but also the loss of the physiological function of sAPPα could contribute to the neurodegenerative effects and the cognitive decline in patients with Alzheimer`s disease The aim of the following study was to investigate the biological properties of the neuroprotective peptide sAPPα under different Alzheimer-relevant stress conditions. In the first part of the thesis proteasomal stress, which is closely associated with AD, was induced by the application of the proteasomal inhibitor Epoxomicin. To investigate the properties of sAPPα, conditioned media of APP-overexpressing HEK293 cells or purified recombinant sAPPα from different expression systems were used. Preincubation with sAPPα antagonized stress-triggered cell death in PC12 cells. Morphological analysis of fragmented nuclei, the uptake of propidium iodide and the analysis of effector-caspase activity confirmed the protective abilities of sAPPα but not of sAPPβ, which differs only in 17 amino acids. The second stress model was established by the application of Thapsigargin, which is known to disturb the intracellular Ca2+-homoeostasis by inhibiting sarco/endoplasmic Ca2+-ATPases. This disruption is a common feature in brain ageing and the pathophysiology of AD, and was employed to induce apoptosis in the present study. Preincubation with sAPPα again showed the ability to antagonize this effect both in PC12 cells and in hippocampal neurons. The protective effect of sAPPα is partially mediated by the inhibition of the pro-apoptotic JNK/c-Jun signalling pathway and the activation of the anti-apoptotic PI3K/Akt signalling pathway, which was shown in both stress models. One possible target for pharmacological intervention is the proteolytic processing of APP. Accordingly, the stimulation of the non-amyloidogenic processing pathway resulting in a higher production of the neuroprotective fragment sAPPα could antagonize the neurotoxic effects of Aβ. In the present study omega-3 fatty acids, e. g. docosahexaenoic acid (DHA), were used to modulate membrane fluidity of APP overexpressing HEK293 cells. The preincubation of the HEK-APP cells with DHA was associated with an increase in membrane fluidity closely correlating with an enhanced secretion of sAPPα. This observed increased non-amyloidogenic APP processing due to the DHA treatment was associated with a protection against apoptosis induced by the disturbance of the sensitive Ca2+-homoeostasis. Finally it was possible to confirm an essential role of sAPPα in mediating the DHA-dependent protective effect.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 09 Dec 2011 10:17
Last Modified: 07 Dec 2012 12:01
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-28100
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Kögel, PD Donat and Layer, Prof Paul G. and Galuske, Prof Ralf A. W.
Refereed: 22 November 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2810
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