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Wechselspiel zwischen Doppelstrangbruch-Reparatur und Zellzyklus-Kontrolle am G2/M-Übergang

Schumann, Eik :
Wechselspiel zwischen Doppelstrangbruch-Reparatur und Zellzyklus-Kontrolle am G2/M-Übergang.
TU Darmstadt Fachbereich Biologie
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Wechselspiel zwischen Doppelstrangbruch-Reparatur und Zellzyklus-Kontrolle am G2/M-Übergang
Language: German
Abstract:

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden das Checkpoint-Verhalten am G2/M-Übergang und die Reparatur der durch Röntgenstrahlen induzierten DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) in G2, M und der G1-Phase untersucht. Um diese Untersuchungen auf der Ebene einzelner Zellen durchzuführen, wurde die Technik der Lebendzellmikroskopie eingesetzt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung eines Inkubators zur CO2-Inkubation während der Mikroskopie und der Optimierung der Versuchsabläufe in der Lebendzellmikroskopie. In Zusammenarbeit mit dem Hersteller wurde die Mikroskopie-Software um Funktionen erweitert, die das zyklische Anfahren multipler Positionen auf dem Objektträger und den Umgang mit einer großen Zahl an Bildern ermöglichte. Die Aufnahmebedingungen wurden optimiert, um eine Schädigung oder Beeinflussung der Zellkultur während der Mikroskopie zu vermeiden. Neben der Technik wurden Verfahren zur Messung des Mitotischen Index und zur Messung der Reparatur von DSBs in der Lebendzellmikroskopie entwickelt, bzw. etabliert. Nach der Etablierung und Optimierung der experimentellen Bedingungen in der Lebendzellmikroskopie wurde die Reparatur von DSBs über die Quantifizierung von GFP-53BP1-Foci untersucht und in Relation zum Zellzyklusverhalten gesetzt. Dabei zeigte sich, dass G2-bestrahlte Zellen einen G2/M-Checkpoint aktivieren, diesen jedoch zu Zeiten aufheben, zu dem die Zellen noch eine hohe Zahl an DSBs enthalten. Auf diese Weise gelangt eine beträchtliche Zahl von DSBs in die Mitose, was einen Befund aus weiteren Arbeiten unserer AG mit fixierten Zellen bestätigte. Die Lebendzellmikroskopie ermöglichte die Verfolgung der in G2 bestrahlten Zellen durch die Mitose und in die G1-Phase hinein und damit die Untersuchung des Schicksals dieser Zellen und der Konsequenzen einer Mitose in Anwesenheit von DSBs. Es stellte sich heraus, dass Zellen, die in G2 bestrahlt wurden und sich teilten, bis 10 h nach Bestrahlung einen höheren Foci-Level aufwiesen als Zellen, die in G1 bestrahlt wurden. Dies ließ darauf schließen, dass DSBs, welche die Mitose durchlaufen haben, in G1 schlechter repariert werden können. Die zur Kontrolle ausgewerteten Foci unbestrahlter Zellen zeigten, dass sich die Zahl spontaner Foci über die Mitose mehr als verdoppelt. Dieses Ergebnis wies auf einen Mechanismus während der Mitose hin, der die Zahl der DSBs vergrößert oder die Reparatur erschwert. Im Folgenden wurde die Mitose, die in ihr vorhandenen DSBs und die Verteilung dieser DSBs auf die Tochterzellen näher untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass Röntgen-Bestrahlung von G2-Zellen Anaphase-Brücken induziert. Anaphase-Brücken sind DNA-Stränge, die während der Anaphase die zu trennenden Chromatiden verbinden. Dieser Befund war durch zwei Mechanismen erklärbar: (i) Fehlerhafte Reparatur über das Nicht-Homologe End-Joining (NHEJ) führt zu dizentrischen Chromosomen, deren Chromatiden in der Anaphase nicht sauber getrennt werden können. Nach der Ausbildung einer Anaphase-Brücke kommt es zum Reißen des Chromosoms und komplexen Schäden am Chromatin. (ii) Im Zuge der DSB-Reparatur über die Homologe Rekombination (HR) werden holliday-junctions zwischen Schwesterchromatiden ausgebildet. Wird der HR-Vorgang nicht vor der Anaphase abgeschlossen, sind die beteiligten Chromatiden nicht sauber trennbar und die resultierende Brücke reißt unter Entstehung größerer Schäden am Chromatin. Um die Rolle der HR und damit die Rolle der unvollständigen Reparatur vor der Checkpoint-Aufhebung für die Entstehung von Anaphase-Brücken zu überprüfen, wurde die HR über eine chemische Inhibition von ATM reduziert. Die Induktion von Anaphase-Brücken nach G2-Bestrahlung ließ sich dadurch vermindern, was tatsächlich auf eine Beteiligung der HR an den Prozessen hindeutet, die in der Mitose zu Anaphase-Brücken führen. Um die Vorgänge in der Mitose weiter zu untersuchen, wurde in der Lebendzellmikroskopie ein weiterer DSB-Marker, ein GFP-MDC1-Konstrukt eingesetzt. Im Gegensatz zu 53BP1, ist MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein 1) auch während der Mitose am DSB lokalisiert. Sowohl in bestrahlten als auch in unbestrahlten Zellen zeigte die Analyse der mitotischen Foci einen sprunghaften Anstieg der Foci-Zahl während der Anaphase auf. Diese Ergebnisse bekräftigten das Modell, dass sowohl spontane als auch durch Röntgenstrahlung induzierte DSBs in der Anaphase zu Strukturen führen, die nicht sauber getrennt werden können. Als Folge entstehen Brücken und zusätzliche, nur schwer zu reparierende Schäden am Chromatin. Da die in der Anaphase reißenden Strukturen und die Entstehung weiterer Schäden nicht mikroskopisch nachvollziehbar waren, wurde anhand eines mathematischen Ansatzes untersucht, ob die in G1 zu findenden Foci im Zusammenhang mit in der Anaphase reißenden Strukturen stehen. Nach obigem Modell sollten die DSBs nach der Anaphase an beiden Chromatiden gleichermaßen zu finden sein. Daher wurde die Verteilung spontaner und induzierter Foci, sowohl in fixierten als auch in lebenden Telophase-Zellen untersucht und gezeigt, dass die Foci-Differenz zwischen den Chromatinmassen in der Telophase geringer war, als statistisch zu erwarten war. Die untersuchten Foci waren also durch einen Mechanismus entstanden, der die DSBs paarweise auf die Schwesterzellen verteilt. Ähnlich zu den Anaphase-Brücken war es wiederrum möglich, durch chemische Inhibition der HR, die koordinierte Verteilung von Foci zu vermindern. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten somit darauf hin, dass ein erhöhter Foci-Level und langsamere Reparatur in G1 zumindest teilweise auf das Durchlaufen der Mitose mit HR-Intermediaten zurückzuführen ist. Dies würde bedeuten, dass ein vorzeitiges Aufheben des G2/M-Checkpoints bei nicht abgeschlossener Reparatur über HR die genomische Integrität gefährdet.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In the course of this thesis, the checkpoint behavior and the repair of ionizing radiation (IR)-induced DNA double strand breaks (DSB) at the G2/M transition has been examined. In order to pursue these evaluations on a single cell level, the sophisticated method of live cell imaging (LCI) was used. The first part of this work emphasised on technical issues. An incubator for humidified, CO2-enriched air on the microscope stand has been developed and the experimental procedures of LCI were optimised. In cooperation with the manufacturer, some features were added to the microscopy software, allowing the cyclic relocation of multiple positions on the slide and the management of the huge amounts of image data generated during LCI. Several imaging conditions were tested to assure that the experimental setup does not disturb or even damage the cells during LCI. Furthermore, a new assay to measure the mitotic index via LCI has been developed and the quantification of IR-induced damage foci in live cell movies was established. After optimization of the experimental setup, DSB repair was measured in living cells using a GFP-53BP1-construct as a DSB marker. To further characterise the interactions between repair and checkpoint behaviour, the time between irradiation and mitosis was monitored for each cell evaluated. Confirming previous results from our laboratory, it became apparent that cells are prematurely released from the G2 arrest at times when cells still contain a considerable number of DSBs. Hence, most G2 irradiated cells enter mitosis with several DSBs, which is considered to threaten the genomic integrity. Using LCI, the DSB repair in G2 irradiated cells was continuously monitored from G2 throughout mitosis and into G1, unfolding the consequences for the cell of having DSBs during mitosis. Strikingly, 10 h after irradiation G2 irradiated cells turned out to possess more foci than G1 irradiated cells. This fact pointed out an event during mitosis which hinders the repair of foci generated in G2. The analysis of spontaneous foci was performed in a similar, cell cycle phase specific manner and showed that the number of foci in unirradiated cells is more than doubled as soon as the cell passes mitosis demonstrating that additional foci are generated in mitosis. The mitosis, mitotic foci and the distribution of foci to the daughter cells became the subject of subsequent experiments. It was shown, that anaphase bridges can be generated by irradiating cells in G2. Anaphase bridges are chromatin-containing crosslinks between separating chromatids during anaphase. These structures are disrupted in later stages of mitosis and are known to cause severe DNA-damage. There were two possible explanations for the generation of bridges after irradiation in G2: (i) Incorrect repair via non homologous end joining (NHEJ) leads to dicentric chromosomes which cannot be divided during anaphase but generate an anaphase bridge. (ii) During repair in G2 via homologous recombination (HR) holliday-junctions are formed which, if not resolved until anaphase, possibly generate anaphase bridges. To differentiate between these two possibilities, repair via HR was silenced by chemical inhibition of ATM, a protein engaged in the initiation of HR. Indeed, the induction of anaphase bridges after irradiation in G2 was attenuated. Thus, the generation of bridges is, at least in part, dependent on HR in G2. Another DSB marker, GFP-MDC1, was used to quantify spontaneous and IR-induced foci in mitosis. In contrast to 53BP1, MDC1 locates to DSBs during cell division. In both, irradiated and unirradiated cells, the number of mitotic foci suddenly rises in anaphase. This observation gave rise to the model that DSBs in G2 cause structures hindering the chromatid separation. The resulting bridges are disrupted and additional DSBs are generated which are repaired slowly in G1 and contribute to the elevated foci levels in G1. Since these mechanisms were not microscopically assessable, a mathematical approach was used to examine the origin of G1-foci. If the model was correct, additional foci are generated from disrupted bridges in mitosis. Without knowing the exact mechanism one can assume that after disruption of the structure there is some sort of severe damage in both of the daughter cells. Accordingly, the distribution of foci in telophase was evaluated to check for coordinated foci distribution to G1 cells. In LCI and in fixed cells IR-induced and spontaneous foci were found to be distributed too evenly to the daughter cells to be distributed by chance. Similar to the induction of anaphase bridges, chemical inhibition of HR was able to attenuate the coordinated distribution of foci revealing HR being, at least in part, responsible for the effect. The experimental data suggests that disrupting structures during mitosis generate additional foci in G1 which are hard to repair. At least in part, these structures originate from not completed repair via HR and cells harbouring these structures enter mitosis due to an early release from the G2 arrest. This demonstrates that the insensitivity of the G2/M checkpoint threatens the genomic integrity.English
Uncontrolled Keywords: DNA-Reparatur, Zellzyklus-Kontrolle, Lebendzellmikroskopie, G2-Checkpoint
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
DNA repair, checkpoint control, live cell microscopy, g2 checkpoint,English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 09 Dec 2011 11:15
Last Modified: 07 Dec 2012 12:01
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-28076
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Loebrich, Prof. Markus and Bertl, Prof. Adam
Refereed: 28 January 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2807
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