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Investigations on mercury sensitivity and molecular determinants of selectivity in two plant aquaporins.

Ayaz, Muhammad :
Investigations on mercury sensitivity and molecular determinants of selectivity in two plant aquaporins.
Institut für Botanik, Fach Biologie, TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Investigations on mercury sensitivity and molecular determinants of selectivity in two plant aquaporins.
Language: English
Abstract:

Aquaporins (AQPs) are members of major intrinsic proteins and form water conducting channels in the biological membranes. These may also transport small solutes as well as gases. The latter are, however, considered to be transported through a separate tetrameric pore. Not much is known about the structure of plant AQPs, particularly in case of TIP sub-family, no structural data is so far available. In the present study, detailed point mutational as well as transmembrane domain swapping analyses were performed to understand the molecular determinants of selectivity in AQPs. The mutational analysis involved substitutions of the native Cys residues in TaTIP2;2 and introduction of an already known Hg-sensitive site belonging to another TIP isoform (gamma-TIP). The results revealed that the presence of a Cys at a particular site in TM3 of the plant TIPs would render them Hg-sensitive. This lead to proposing a consensus region of metal sensitivity in plant AQPs (similar to the one in mammalian AQPs) for accommodating a Hg-sensitive Cys. A significant part of the study involved identification of molecular signatures of selectivity located both inside and outside the selectivity regions (ar/R region and NPA motif) of AQPs. The sequence alignment including predominantly water conducting AQPs in comparison to the ammonia conducting ones suggested a couple of positions with the residues distinguishable between the two AQP sub-families. The amino acid substitutions at the corresponding positions of TaTIP2;2 and NtPIP2 couldn’t turn the PIP into an ammonia-conducting channel however, a drastic effect of the said mutations on water permeability of PIP (and not of TIP) was observed suggesting their role in the water transport function of the PIPs sub-family. As TIP mutants retained their ammonia transport function similar to the wild type, the varying effects of the given residues may be attributed to the difference in structure between TIPs and PIPs besides pointing towards the presence of a central pore in AQPs. As regards the mutations inside the selectivity regions, none of the mutants was functional for water and ammonia transport. Same was the case with a number of chimeric proteins containing different transmembrane domains swapped between TIP and PIP. However, the leakage of protons could be demonstrated in some of these AQP variants. For future studies, the joint mutations combining the molecular signatures suggested in the present study with those located inside the selectivity regions may help to further understand the molecular mechanism of selectivity.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Aquaporine (AQPs) gehören zu den „major intrinsic proteins" und bilden Wasser-leitfähige Kanäle in biologischen Membranen. Diese können auch kleine gelöste Moleküle sowie Gase transportieren. Von letzteren wird jedoch angenommen, dass sie durch eine eigene, tetramere pore transportiert werden. Über die Struktur pflanzlicher AQPs ist nicht viel bekannt. Insbesondere im Falle der TIP Unterfamilie sind bislang keine Strukturdaten verfügbar. Um die molekularen Grundlagen der Selektivität in AQPs besser zu verstehen, wurden in der vorliegenden Studie detailierte Analysen von Punktmutationen, sowie von Austauschen von Transmembrandomänen durchgeführt. Die Analyse von Mutationen beinhaltete Substitution der nativen Cysteine in TaTIP2;2 und Einführung einer bereits aus einer anderen TIP Isoform (gamma- TIP) bekannten Hg-sensitiven Position. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vorhandensein eines Cysteins an einer bestimmten Position in TM3 pflanzliche TIPs Hg-sensitive macht. Dies führte dazu, in Pflanzen-AQPs eine Consensus-Sequenz für Metallsensitivität, ähnlich der in AQPs der Säuger, zu postulieren, die ein Hg-sensitives Cystein beherbergt. Ein signifikanter Teil der Studie beinhaltete Identifikation molekularer Signaturen für Selektivität, sowohl innerhalb, als auch ausserhalb der sogenannten Selektivitätsregion (ar/R region und NPA Motiv) von AQPs. Ein Sequenzvergleich von hauptsächlich Wasser-leitenden AQPs mit Ammoniak-leitenden Aquaporinen identifizierte einige Positionen, deren Aminosäuren sich in den beiden Unterfamilien unterscheiden. Aminosäureaustausche an den entsprechenden Positionen von TaTIP2;2 und NtPIP2 konnten PIP nicht in einen Ammoniak-transportierenden Kanal verwandeln. Ein drastischer Effekt dieser Mutanten auf die Wasserpermeabilität von PIP (jedoch nicht von TIP) konnte beobachten werden, was die Vermutung zulässt, dass diese Positionen eine wichtige Rolle im Wassertransport der PIP-Unterfamilie spielen. Da die TIP-Mutanten Ammoniak-Transport Funktion ähnlich dem Wildtyp beibehielten, könnten die unterschiedlichen Effekte besagter Reste strukturellen Unterschieden zwischen TIPs und PIPs zugeschrieben werden, sowie auf das Vorhandensein einer zentralen Pore hinweisen. Von den Mutationen innerhalb der Selektivitätsregionen war keine funktional im Transport von Wasser oder Ammoniak. Dies war ebenfalls der Fall bei einer Reihe chimärer Proteine, die Austausche in verschiedenen Transmembrandomänen zwischen TIPs und PIPs enthielten. Allerdings konnte in einigen dieser AQP-Varianten ein Protonen-Leak gezeigt werden. In zukünftigen Studien könnten Mutationen, die die molekularen Signaturen, die in der vorliegenden Arbeit postuliert wurden mit denen innerhalb der Selektivitätsregionen kombinieren, helfen, die molekularen Mechanismen der Selektivität besser zu verstehen.German
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 09 Nov 2011 11:36
Last Modified: 07 Dec 2012 12:01
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-27825
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Kaldenhoff, Prof. Dr. Ralf and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 18 October 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2782
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