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Characterization of novel potassium transport proteins from Chlorella viruses

Greiner, Timo :
Characterization of novel potassium transport proteins from Chlorella viruses.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Characterization of novel potassium transport proteins from Chlorella viruses
Language: English
Abstract:

Large DNA viruses are a source of transport proteins with minimal structure and robust function. In the first part I characterized two new variants of the K+ channel Kcv. The two Kcvs, namely KcvSmith and KcvNext-to-Smith, have a monomer size of only 82 amino acids, but exhibit most of the hallmarks of K+ channel pores, i.e. two transmembrane domains (TMs), a pore region and a selectivity filter, with the conserved sequence TxxTxGYGD. The two channels differ in 11 amino acids with most of the differences in the outer and the inner TM. Both channels are fully functional with selectivity for K+; they also conduct Rb+ and NH4+, but no Na+ and Li+. The selectivity of the two channels differs, even though they have an identical filter region. Mutational studies revealed that an exchange of a single amino acid in the outer TM already changed in KcvNext-to-Smith the selectivity for K+ and Rb+ towards the selectivity of KcvSmith, implying a relevance of the outer TM for selectivity. The two channels are sensitive to Ba2+ and Cs+, but not to TEA or amantadine. Both channels are fully blocked by Ba2+ and the responsible binding site for Ba2+ in the filter region could be identified by site-directed mutagenesis. Most notable is the difference in the mode of Cs+ block. While KcvSmith was blocked is a moderate voltage-dependent manner, KcvNext-to-Smith showed an extremely steep block with complex kinetics. Again, mutational studies revealed the relevance and sensitivity of the amino acid composition in the outer TM for the block.

The second protein of interest is a putative K+ transporter encoded by virus Fr483. Analysis of the sequence revealed high similarity to plant potassium transporters including a conserved putative signature sequence; topology prediction algorithms revealed structural similarity with known K+ transporters. Yeast complementation assays and Rb+ uptake experiments have shown that the transporter protein is functional. Northern blot hybridization confirmed that the transporter gene is expressed during the infection cycle. The function of the protein is yet unclear. Overall, this is the first functional potassium transporter encoded by a virus.

In the third part, we made phylogenetic analyses together with the group of Prof. Hamacher (TU Darmstadt). The generated trees show that K+ channels from the alga Chlorella NC64A are most distantly related to channels of viruses, which infect it, thus, they were most likely not acquired from the hosts. By generating a consensus sequence of the viral channels we also found a bacterial protein, which has high sequence similarity to KcvATCV-1, but is probably not a K+ channel. Overall, it is not clear from were the chlorella viruses acquired their channel proteins, and it is possible that they are even the architects of these.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Große DNA-Viren sind eine Quelle für Transport-Proteine mit minimaler Struktur und robuster Funktion. Im ersten Teil habe ich zwei neue Varianten des Kaliumkanals Kcv charakterisiert. Die beiden Kcvs, KcvSmith und KcvNext-to-Smith, habe eine Länge von nur 82 Aminosäuren pro Monomer, weisen aber alle Merkmale einer Kaliumkanal-Pore auf, dies sind zwei Transmembran-Domänen (TMs), eine Poren-Region und ein Selektivitäts-Filter mit der konservierten Sequenz TxxTxGYGD. Die beiden Kanäle unterscheiden sich in 11 Aminosäuren vor allem in der äußeren und der inneren TM. Beide Kanäle sind voll funktionell mit Selektivität für K+; sie leiten zudem Rb+ und NH4+, aber kein Na+ und kein Li+. Die Selektivität der beiden Kanäle unterscheidet sich, obwohl sie identische Filter-Regionen haben. Mutations-Studien zeigten, dass der Austausch einer einzelnen Aminosäure in der äußeren TM von KcvNext-to-Smith bereits die Selektivität für K+ und Rb+ in Richtung der Selektivität von KcvSmith verschiebt, was die Relevanz der äußeren TM für die Selektivität andeutet. Die zwei Kanäle sind sensitiv gegenüber Ba2+ und Cs+, aber nicht gegenüber TEA oder Amantadin. Beide Kanäle werden komplett durch Ba2+ blockiert und die verantwortliche Bindestelle für Ba2+ in der Filter-Region konnte durch site-directed Mutagenese identifiziert werden. Vor allem bemerkenswert ist der Unterschied im Caesium-Block. Während KcvSmith in moderat spannungsabhängiger Weise blockiert wurde, zeigte KcvNext-to-Smith einen extrem steilen Block mit komplexer Kinetik. Wieder zeigten Mutations-Studien die Relevanz und Sensitivität der Aminosäure-Zusammensetzung der äußeren TM für den Block. Das zweite Protein von Interesse ist ein putativer Kaliumtransporter der vom Chlorella-Virus Fr483 kodiert wird. Die Analyse der Sequenze zeigte hohe Ähnlichkeit zu pflanzlichen Kaliumtransportern, inklusive einer konservierten putativen Signatur-Sequenz; Topologie-Vorhersage-Algorithmen zeigten eine strukturelle Ähnlichkeit zu bekannten Kaliumtransportern. Hefe-Komplementations-Tests und Rb+-Aufname-Experimente haben gezeigt, dass das Transporter-Protein funktionell ist. Northern Blot-Hybridisierung bestätigte, dass das Transporter-Protein während des Infektionszyklus exprimiert wird. Die Funktion des Proteins ist noch unklar. Alles in allem ist dies der erste funtkionelle Kalium-Transporter, der von einem Virus kodiert wird. Im dritten Teil haben wir zusammen mit der Gruppe von Prof. Hamacher (TU Darmstadt) phylogenetische Analysen durchgeführt. Die erzeugten Bäume zeigen, dass Kaliumkanäle von der Alge Chlorella NC64A am weitesten von Kanälen entfernt sind, die von Viren stammen, die sie infizieren, was bedeutet, dass letztere wahrscheinlich nicht vom Wirt übernommen wurden. Durch Erzeugung einer Konsensus-Sequenz der viralen Kanäle haben wir zudem ein bakterielles Protein gefunden, das eine hohe Sequenz-Ähnlichkeit zu KcvATCV-1 hat, aber wahrscheinlich kein Kaliumkanal ist. Insgesamt ist nicht klar woher die Chlorella-Viren ihre Kanäle haben, und es ist möglich, dass sie sogar die Architekten dieser sind.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 27 Jul 2011 07:39
Last Modified: 07 Dec 2012 12:00
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-26851
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Thiel, Professor Gerhard and Bertl, Professor Adam
Refereed: 15 July 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2685
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