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Modifikation von Proteinen mittels Photosensibilisatoren für die strukturierte Proteinimmobilisierung und Quervernetzung von Biomaterialien

Eckes, Stefanie (2024)
Modifikation von Proteinen mittels Photosensibilisatoren für die strukturierte Proteinimmobilisierung und Quervernetzung von Biomaterialien.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00026689
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Modifikation von Proteinen mittels Photosensibilisatoren für die strukturierte Proteinimmobilisierung und Quervernetzung von Biomaterialien
Language: German
Referees: Schmitz, Prof. Dr. Katja ; Kolmar, Prof. Dr. Harald
Date: 23 February 2024
Place of Publication: Darmstadt
Collation: vi, 92, XVII Seiten
Date of oral examination: 12 February 2024
DOI: 10.26083/tuprints-00026689
Abstract:

Photosensibilisatoren ermöglichen die Modifikation von Proteinen durch Bestrahlung mit sichtbarem Licht. So können Proteine quervernetzt oder gezielt in einem belichteten Bereich immobilisiert werden. Beides ist von Bedeutung für die biomedizinische Forschung, etwa im Bereich der Wirkstofffreisetzung aus quervernetzten Proteinmatrices, zur Herstellung diagnostischer Assays oder zur Untersuchung des Zellverhaltens auf strukturierten Oberflächen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Proteine mittels proteinadsorption by photobleaching (PAP) oder durch rose bengal and green light crosslinking (RGX) auf Oberflächen immobilisiert oder quervernetzt. In beiden Methoden kommen Photosensibilisatoren zum Einsatz, die durch sichtbares Licht angeregt werden und im Triplett-Zustand mit der Umgebung reagieren können. Während bei PAP der Photosensibilisator, meist Fluorescein, am Protein konjugiert vorliegt, wird bei RGX der Photosensibilisator Bengalrosa zum Protein hinzugegeben.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Photoimmobilisierung mittels PAP untersucht, bei der die Belichtung oftmals mit einem Laser oder Mikrospiegelarray (digital mirror device, DMD) realisiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einsatz einer Power-LED als lichtstarke kostengünstige Variante für die PAP-Methode untersucht werden und der Belichtung mittels Konfokalmikroskop und DMD gegenübergestellt werden. Hierbei wurde untersucht, ob der Photosensibilisator nicht nur am Protein konjugiert, sondern ebenfalls frei in Lösung oder an der Oberfläche adsorbiert eingesetzt werden kann. Zudem wurden Photosensibilisatoren unterschiedlicher Triplett-Quantenausbeute verwendet und die Effizienz der Proteinimmobilisierung verglichen. Für die Immobilisierungen wurden Biotin und das Modellchemokin IL-8 genutzt. Chemokine sind kleine Signalproteine, die die Migration von Zellen bei Entzündungsreaktionen und in der Homöostase des Immunsystems induzieren und lenken. Durch die Präsentation von Chemokinen auf Oberflächen in Form von gebundenen Gradienten, lässt sich die Migration von Zellen (Haptotaxis) untersuchen. Die Immobilisierung von IL-8 mit der PAP-Methode wurde außerdem mit der konventionellen Photoimmobilisierung über Benzophenon, das mit UV-Licht angeregt wird, verglichen. Bei den Immobilisierungsversuchen von IL-8 mittels Benzophenon auf Polystyrol- bzw. auf mit PMMA beschichteten Polystyrol-Oberflächen konnten keine ausreichend hohen Verhältnisse in der Fluoreszenzintensität zwischen dem belichteten und unbelichteten Bereich (Signal-zu-Hintergrund (S/HG)-Verhältnis) erzeugt werden. Im Gegensatz dazu verlief die Immobilisierung von Biotin-5-Fluorescein auf mit BSA beschichteten Glasobjektträgern mittels Power-LED erfolgreich. Anhand dieses Modellsystems wurden sowohl Konzentration als auch Belichtungszeit optimiert und anschließend auf die Immobilisierung von mit Fluorescein konjugiertem IL-8, IL-8-S72C-Fluorescein, übertragen. Hierbei waren allerdings belichtete Bereiche kaum von nicht belichteten Bereichen zu unterscheiden. Es wurde vermutet, dass IL 8 eine unspezifische Wechselwirkung mit der BSA-beschichteten Oberfläche einging. Die Immobilisierung von IL-8-S72C-Fluorescein bzw. IL-8 mit freiem Fluorescein mittels DMD war auf NH2- und Methacrylsäure-3-(dimethyl-chlorsilyl)-propylester (MACS)-funktionali-sierten Glasobjektträgern erfolgreich. Das größte in dieser Arbeit erhaltene S/HG-Verhältnis wurde dabei auf MACS-funktionalisierten Oberflächen erhalten, mit denen IL-8-S72C-Fluorescein nachweislich nicht unspezifisch wechselwirkte. Mittels konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop (confocal laser scanning microscope, CLSM) konnte eine Immobilisierung von IL 8 S72C-Fluorescein auf BSA-Glasobjektträgern im roten Kanal nicht nachgewiesen werden. Im grünen Kanal wurden invertierte Muster erhalten. Vermutlich wurde das Protein durch zu lange bzw. zu intensive Belichtung oxidativ geschädigt. Im Gegensatz dazu, konnte IL-8 wt mit freiem Fluorescein nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass der oxidative Schaden geringer war, da Fluorescein nicht direkt an IL-8 gebunden vorlag. Da Fluorescein eine geringe Triplett-Quantenausbeute besitzt, wurde die Immobilisierung von Biotin und IL-8 mit den Photosensibilisatoren Eosin Y, Erythrosin B und Bengalrosa untersucht, die eine höhere Triplett-Quantenausbeute besitzen, und damit effektiver mit der Umgebung reagieren sollten. Die besten Ergebnisse wurden dabei unter Nutzung von mit Bengalrosa und Rattenschwanzkollagen bzw. Gelatine beschichteten Glasobjektträgern erzielt. Unter Verwendung eines Konfokalmikroskops konnten die Ergebnisse der Immobilisierung von IL 8 wt auf mit Rattenschwanzkollagen und Bengalrosa beschichteten Glasobjektträgern weiter verbessert werden. In nachfolgenden Arbeiten wurde die Immobilisierung von IL-8 mittels Bengalrosa auf Kollagen in Mikrofluidikkanälen untersucht. Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse, dass die Art bzw. Intensität der Strahlungsquelle bei der Immobilisierung von Biomolekülen eine entscheidende Rolle spielt. Die Belichtungen mittels DMD und CLSM führten zu größeren S/HG-Verhältnissen als die Belichtungen über Power-LED mit Lochmasken.

Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Quervernetzung von Proteinen mittels RGX, was für unterschiedliche klinische Anwendungen beispielweise in der Augenheilkunde oder Orthopädie genutzt wird. RGX kann die mechanische Stabilität von Kollagenhydrogelen erhöhen, die dann beispielsweise zur kontrollierten lokalen Wirkstofffreisetzung genutzt werden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden daher zunächst drei verschiedene Kollagensheets (Collagen Solutions, Viscofan, Atelocollagen) unterschiedlicher Dicken und Dichten charakterisiert und die Wirkung von RGX auf Eigenschaften wie Mikrostruktur, Quellgrad, mechanische Stabilität und Freisetzung des Antibiotikums Vancomycin untersucht. Zur Beurteilung der mechanischen Stabilität wurde die Dicke unter Krafteinfluss mit Hilfe eines Höhenmessgeräts gemessen. Darüber hinaus wurde untersucht, ob mittels RGX einzelne Schichten aus Kollagen stabil miteinander verbunden werden können. Damit sollte die Grundlage für Kollagenbiomaterialien mit maßgeschneiderten Eigenschaften, wie z.B. einer kontrollierten Freisetzung von Antibiotikum zur Vorbeugung von Entzündungen, geschaffen werden. Während es sich bei Collagen Solutions um eine dünne, flexible Kollagenfolie handelt, deren Mikrostruktur keine erkennbare Faserstruktur zeigte, besteht Viscofan aus einer sehr kompakten Struktur mit langen Fasern, die mittels mikroskopischer Analyse sichtbar waren. Atelocollagen wiederum ist ein schwammartiges unvernetztes und nach Quellung labiles Material, dessen große Poren unter dem Durchlicht- und Rasterelektronenmikroskop erkennbar waren. Die Behandlung mittels RGX hatte im Fall von Collagen Solutions lediglich einen Einfluss auf die Dicke, die bei 37 °C bei modifizierten Proben geringer war als bei unmodifzierten Proben. Im Fall von Viscofan wurden durch RGX mit 0,1 % RB und 10 min Belichtungszeit ein geringerer Quellgrad und eine geringere Dicke erhalten. Die größte Veränderung der Eigenschaften durch RGX wurde für das offene, schwammartige Atelocollagen gemessen. Bei Konzentrationen von Bengalrosa von 0,01 % bzw. 0,1 % wurde der Quellgrad im Vergleich zu unmodifizierten Proben bei 37 °C um ca. 20 % bzw. ca. 40 % reduziert. Die unter Krafteinwirkung gemessene Dicke war bei 37 °C für 0,01 % RB und 0,1 % RB im Durchschnitt 7-mal größer als die der unmodifizierten Proben. Bei Raumtemperatur betrugen die Dicken des modifizierten Atelocollagens das 27-fache der unmodifizierten Variante. Diese Ergebnisse deuteten auf eine deutliche Steigerung der mechanischen Festigkeit hin. Die Mikrostruktur-analyse ergab, dass die schwammartige Struktur nach Behandlung mittels RGX durch eine faserige Struktur ersetzt wurde. Der anfängliche Burst-Effekt während der Vancomycin-Freisetzung wurde durch die Vernetzung jedoch nicht beeinflusst. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es zudem unterschiedliche Kollagensheets mittels RGX zu Kollagenlaminaten zu verbinden. Die mechanische Charakterisierung zeigte, dass die Dicke der Laminate, bestehend aus Atelocollagen und Collagen Solutions, größer war als die Summe der Dicken der betreffenden unmodifizierten Proben. Die mechanische Stabilität von Atelocollagen konnte entsprechend durch den Verbund mit Collagen Solutions erhöht werden. Die in dieser Arbeit optimierten Parameter zur Laminatherstellung konnten bereits in Folgearbeiten angewendet und für die systematische Untersuchung der Vancomycin-Freisetzung aus Kollagenlaminaten genutzt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass im Handel erhältliche Kollagensheets mittels RGX vernetzt werden können, um ihre Eigenschaften anzupassen. Die größte Wirkung zeigte sich beim unvernetzten, schwammartigen Atelocollagen, das durch RGX stabilisiert wurde, was in einem reduzierten Quellungsgrad und einer erhöhten Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischem Druck resultierte. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass RGX zur Herstellung von Kollagenlaminaten verwendet werden kann, um Materialien mit kombinierten Eigenschaften zu schaffen. Dies macht die Modifikation und Kombination leicht verfügbarer Kollagensheets mittels RGX zu einem attraktiven Ansatz für die klinische Anwendung.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Photosensitizers enable the modification of proteins through irradiation with visible light. This allows for proteins to be crosslinked or selectively immobilized in an illuminated area, both of which are significant for biomedical research, such as in the field of drug release from crosslinked protein matrices, for diagnostic assays, or for investigating cell behavior on structured surfaces.

In this work, proteins were immobilized or crosslinked on surfaces using protein adsorption by photobleaching (PAP) or rose bengal and green light crosslinking (RGX). Both methods employ photosensitizers that are excited by visible light and can react with the environment in a triplet state. While in PAP, the photosensitizer, usually fluorescein, is conjugated to the protein, in RGX, the photosensitizer rose bengal is added to the protein.

The first part of this work investigated photoimmobilization using PAP, where exposure is often realized with a laser or a digital mirror device (DMD). This work aimed to explore the use of a power LED as a cost-effective high-intensity light source for the PAP method and to compare it with exposure using confocal microscopy and DMD. The study examined whether the photosensitizer could be used not only conjugated to the protein but also freely in solution or adsorbed on the surface. Additionally, photosensitizers with different triplet quantum yields were used, and the efficiency of protein immobilization was compared. Biotin and the model chemokine IL-8 were utilized for immobilizations. Chemokines are small signaling proteins that induce and direct cell migration in inflammatory reactions and immune system homeostasis. By presenting chemokines on surfaces in the form of bound gradients, cell migration (haptotaxis) can be investigated. The immobilization of IL-8 using the PAP method was also compared to conventional photoimmobilization via benzophenone, which is excited by UV light.

Attempts to immobilize IL-8 using benzophenone on polystyrene or PMMA-coated polystyrene surfaces did not produce sufficiently high signal-to-background ratios in fluorescence intensity between the exposed and unexposed areas. In contrast, immobilization of biotin-5-fluorescein on BSA-coated glass slides using a power LED was successful. Using this model system, both concentration and exposure time were optimized and then transferred to the immobilization of IL-8 conjugated with fluorescein, IL-8-S72C-fluorescein. However, exposed areas were hardly distinguishable from unexposed areas, indicating potential nonspecific interaction between IL-8 and the BSA-coated surface. Immobilization of IL-8-S72C-fluorescein or IL-8 with free fluorescein using DMD was successful on NH2- and methacrylic acid-3-(dimethyl-chlorosilyl)-propyl ester (MACS)-functionalized glass slides. The highest signal-to-background ratio obtained in this work was achieved on MACS-functionalized surfaces, where IL-8-S72C-fluorescein did not exhibit unspecific interactions. Via confocal laser scanning microscopy (CLSM) immobilization of IL-8 S72C-fluorescein on BSA-coated glass slides could not be detected in the red channel, while inverted patterns were observed in the green channel, possibly due to oxidative damage from prolonged or intense exposure. In contrast, IL-8 wt with free fluorescein could be detected, suggesting lower oxidative damage as fluorescein was not directly bound to IL-8. Due to fluorescein's low triplet quantum yield, immobilization of biotin and IL-8 with the photosensitizers Eosin Y, Erythrosin B, and rose bengal, which have higher triplet quantum yields and thus should react more effectively with the environment, was examined. The best results were achieved using glass slides coated with rose bengal and rat tail collagen or gelatin. Using confocal microscopy, the results of immobilization of IL-8 wt on glass slides coated with rat tail collagen and rose bengal were further improved. In subsequent work, immobilization of IL-8 using rose bengal on collagen in microfluidic channels was investigated. In summary, the results showed that the type and intensity of the radiation source play a crucial role in the immobilization of biomolecules. Exposures using DMD and CLSM resulted in higher signal-to-background ratios than exposures using power LEDs with masks.

The second part of this work focused on protein crosslinking using RGX, which is utilized for various clinical applications such as in ophthalmology or orthopedics. RGX can increase the mechanical stability of collagen hydrogels, which can then be used, for example, for controlled local drug release. Therefore, in the second part of this work, three different collagen sheets (Collagen Solutions, Viscofan, Atelocollagen) of varying thicknesses and densities were characterized, and the effect of RGX on properties such as microstructure, swelling degree, mechanical stability, and release of the antibiotic vancomycin was investigated. To assess mechanical stability, thickness under force influence was measured using a height gauge. In addition, it was investigated whether individual layers of collagen can be stably connected to one another using RGX. This was intended to lay the foundation for collagen biomaterials with tailored properties, such as controlled antibiotic release for inflammation prevention. While Collagen Solutions is a thin, flexible collagen film whose microstructure showed no discernible fiber structure, Viscofan consists of a very compact structure with long fibers that were visible through microscopic analysis. Atelocollagen, on the other hand, is a sponge-like, non-crosslinked, and after swelling unstable material, whose large pores were visible via transmitted light and scanning electron microscopy. Treatment with RGX only influenced the thickness of Collagen Solutions, which was lower in modified samples at 37 °C compared to unmodified samples. For Viscofan, RGX with 0.1 % RB and 10 minutes of exposure resulted in reduced swelling degree and thickness. The most significant changes in properties due to RGX were observed for the open, sponge-like Atelocollagen. At concentrations of rose bengal of 0.01 % and 0.1 %, the swelling degree at 37 °C was reduced by approximately 20 % and 40 %, respectively, compared to unmodified samples. The thickness measured under force at 37 °C was on average 7 times greater for 0.01 % RB and 0.1 % RB than that of unmodified samples. At room temperature, the thickness of modified Atelocollagen was 27 times that of the unmodified variant. These results indicated a significant increase in mechanical strength. Microstructural analysis revealed that the sponge-like structure was replaced by a fibrous structure after treatment with RGX. However, the initial burst effect during vancomycin release was not affected by crosslinking. Furthermore, in this work, different collagen sheets were successfully connected into collagen laminates using RGX. Mechanical characterization showed that the thickness of the laminates, consisting of Atelocollagen and Collagen Solutions, was greater than the sum of the thicknesses of the respective unmodified samples. The mechanical stability of Atelocollagen could thus be increased by combining it with Collagen Solutions. The parameters for laminate production optimized in this work could already be applied in subsequent work for the systematic investigation of vancomycin release from collagen laminates.

In summary, it was shown that commercially available collagen sheets can be crosslinked using RGX to adapt their properties. The greatest effect was seen with non-crosslinked, sponge-like Atelocollagen, which was stabilized by RGX, resulting in a reduced swelling degree and increased resistance to mechanical pressure. It has also been shown that RGX can be used to produce collagen laminates to create materials with combined properties. This makes the modification and combination of readily available collagen sheets using RGX an attractive approach for clinical use.

English
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-266899
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 23 Feb 2024 13:09
Last Modified: 27 Feb 2024 14:43
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/26689
PPN: 515805041
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