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Superkomplexe aus Algen und Cyanobakterien - Isolierung, Charakterisierung und strukturelle Untersuchung

Heidrich, Nicolas Georges :
Superkomplexe aus Algen und Cyanobakterien - Isolierung, Charakterisierung und strukturelle Untersuchung.
Clemens-Schöpf-Institut für Organische Chemie und Biochemie
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Superkomplexe aus Algen und Cyanobakterien - Isolierung, Charakterisierung und strukturelle Untersuchung
Language: German
Abstract:

Seit über 10 Jahren ist bekannt, dass in Mitochondrien von Säugetieren, Pilzen, höheren Pflanzen und Algen die Atmungskettenkomplexe I, III und IV stöchiometrisch als Proteinsuperkomplexe zusammengelagert sind. Diese Superkomplexe bestehen in den bisher bekannten Formen aus einer Kopie von Komplex I, einem Homodimer von Komplex III, welcher nur als solcher aktiv ist, und einer unterschiedlichen Anzahl (0-4) an Komplex IV. Vermutlich erfolgt der Elektronentransport zwischen den Atmungskettenkomplexen wesentlich effizienter, wenn diese nicht in individueller Form sondern als Superkomplexe vorliegen. Die ATP-Synthase in Mitochondrien und Chloroplasten existiert ebenfalls in oligomerer Form. Denkbar ist, dass Dimere dieses Enzymkomplexes strukturgebend für Krümmungen von inneren Membranen in Mitochondrien und Chloroplasten sind. Ziel meiner Arbeit war es, neue Einblicke in die Struktur und Funktionsweise von pflanzlichen Proteinsuperkomplexen sowie ATP-Synthase-Dimeren aus Chloroplasten zu erhalten. Hierzu erfolgten biochemische Charakterisierungen und strukturelle Untersuchungen an Proteinen und Organellen aus verschiedenen einzelligen Organismen (C. reinhardtii, E. gracilis, A. longa, N. muscorum und C. paradoxa). Mit Hilfe der Einzelpartikelanalyse wurden hochreine, isolierte Proteinsuperkomplexe elektronenmikroskopisch abgebildet. Mittels dieser Methode konnte ein Einblick in die Struktur eines Superkomplexes mit einer apparenten Masse von ca. 2000 kDa aus E. gracilis-Mitochondrien erhalten werden. Für Struktur-Untersuchungen von ATP-Synthase-Dimeren direkt in Chloroplasten kam die Cryo-Elektronen-Tomographie zum Einsatz, mittels derer verschiedene Ebenen innerhalb von Thylakoidmembranen inklusive der darin enthaltenen Proteinkomplexe abgebildet wurden. Um die hohen Anforderungen an die Probenreinheit für elektronenmikroskopische Untersuchungen zu erfüllen, bestand ein weiteres Ziel meiner Arbeit darin, sowohl reine Proteinsuperkomplexe in ausreichend hoher Konzentration zu isolieren als auch wenig verunreinigte Chloroplasten aus Organellengemischen zu erhalten. Hierzu wurden Proteingemische über Saccharose-Dichtegradienten bzw. verschiedener Arten der nativen Polyacrylamidgelelektrophorese (CN-, BN-PAGE) aufgetrennt und per Elution aus diesen Gelen die gereinigten Proteinkomplexe isoliert. Zur Reinigung von Organellengemischen kamen Dichtegradientenzentrifugationen mit Gradientenlösungen niedriger Osmolarität zum Einsatz.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Since more than 10 years it is known that in mitochondria from mammals, fungi, higher plants and algae the protein complexes I, III and IV of the respiratory chain exist as supercomplexes. The to date known composition of these supercomplexes is one copy of complex I, a homodimer of complex III which is only active as such and different copies (0-4) of complex IV. The organization of respiratory chain complexes as supercomplexes leads probably to a more efficient electron transport compared to the transport via individually arranged complexes. The ATP-synthase exists in mitochondria and chloroplasts as an oligomer as well. Possibly dimers of this protein complex are involved in the cristae formation in mitochondria or the formation of bended inner membranes in chloroplasts. The aim of my work was to get new insights into the structure and function of supercomplexes from plants and ATP-synthase-dimers of chloroplasts. Therefore biochemical characterization and structural analysis of proteins and organelles from different unicellular organisms (C. reinhardtii, E. gracilis, A. longa, N. muscorum and C. paradoxa) were carried out. Isolated protein supercomplexes of high purity were analyzed via electron microscopy. Single particle analysis provided structural insights into a mitochondrial supercomplex from E.gracilis with an apparent mass of 2000 kDa. In order to investigate the structure of ATP-synthase-dimers directly in chloroplasts, the method of cryo-electron tomography was suitable. Hereby different layers of thylakoid membranes were visualized including all protein complexes located within these membranes. To fulfill the high demand of sample purity for electron microscopical analysis, another goal of my work was to isolate pure protein complexes in sufficient high concentration as well as to gain relatively pure chloroplasts from organelle mixtures. Therefore, protein mixtures were separated via sucrose density gradients and different kinds of native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-, CN-PAGE), respectively. The isolation of these purified protein complexes occurred by elution from the gels. In order to purify mixtures of organelles the method of choice was density gradient centrifugation with gradient solutions of low osmolarity.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: Fachbereich Chemie > Biochemie
Date Deposited: 07 Jul 2011 09:43
Last Modified: 07 Dec 2012 12:00
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-26595
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Dencher, Prof. Dr. Norbert A. and Friedl, Prof. Dr. Peter
Refereed: 24 May 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2659
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