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Anti-idiotype antibodies for biomedical applications

Habermann, Jan (2024)
Anti-idiotype antibodies for biomedical applications.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00026540
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Anti-idiotype antibodies for biomedical applications
Language: English
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Ullrich, Prof. Dr. Evelyn
Date: 5 February 2024
Place of Publication: Darmstadt
Collation: VI, 154 Seiten
Date of oral examination: 15 December 2023
DOI: 10.26083/tuprints-00026540
Abstract:

Therapeutic antibodies have become an indispensable part of today's medicine. In addition to the implementation of antibodies in the treatment of a variety of different diseases, the most important area of application is cancer treatment. Approved antibodies all share the disadvantage of addressing tumor related antigens, which are overexpressed on tumor cells, but can also be found on the surface of healthy cells. Due to this fact, severe side effects can occur during antibody treatment. In order to decrease the risks of side effects, several approaches have been pursued including bispecific, immunomodulatory, pH-dependent and protease activatable antibodies. They are later activated by tumor-associated proteases that are weakly expressed in healthy tissue. Additionally, a masking domain is required. These masking domains can either consist of bulky domains interfering with target by steric hinderance or tailor-made affinity-based masking domains. In this work different approaches were pursued to obtain masking domains based on shark-derived single domain antibodies (vNARs) and chicken-derived single-chain fragment variables (scFvs) directed against different antibodies of therapeutic relevance. In case of the vNARs one approach was based on an existing vNAR directed against matuzumab, which displayed an inhibitory effect on the matuzumab-EGFR interaction. Histidine-doping of the CDR3 of the vNAR resulted in a pH-dependent binding behavior with strongly decreased affinity. The loss of affinity could be overcome neither using a SEED-based nor a heavy or light chain fusion approach. Another part of this project was aimed at the de novo isolation of pH-dependent vNARs directed against rituximab (anti-CD20 antibody) and 5F9 (anti-CD47 antibody). Isolation of pH-dependent vNARs was successful for both antibodies. Two vNARs directed against 5F9 were isolated, while four vNARs directed against rituximab were obtained; one of which has been further characterized. Both vNARs directed against 5F9 and the one analyzed vNAR against rituximab exhibited masking properties in co-incubation experiments of the respective antibody with the respective target cell line. While the masking properties of the vNAR directed against 5F9 could not be observed in any SEED or light chain construct, the vNAR directed against rituximab displayed masking effects in SEED and light chain constructs. The vNAR was fused to the light chain of rituximab via several MMP-9 cleavable linkers. In case of the SEED constructs pH-dependent restoration of binding was observed, while binding of light chain fusions was restored upon MMP-9 cleavage. In case of one further analyzed light chain fusion, the masking effect in the light chain construct could be attributed to the linker and not the vNAR itself. The third project in this work was aimed at the isolation of anti-idiotype like vNARs directed against a T cell receptor (TCR). During the screening process, four vNARs were obtained, but only one revealed specific TCR binding, while the other variants displayed binding towards constant domains. The last project in this work was aimed at the isolation of anti-idiotype chicken scFvs from an immune library based on the immunization of a chicken with the scFv of the therapeutic antibody 6G11 (anti-CD32b antibody). By implementing CD32b into the screening process, scFvs interfering and non-interfering with the 6G11-CD32b interaction could be isolated. Fusion of the scFv obtained from the interfering screening approach resulted in 2700-fold reduction of binding compared to the unmasked 6G11. Upon MMP-9 cleavage, binding was restored, but partly removal of the scFv was required for further restoration of binding.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Therapeutische Antikörper sind aus der heutigen Medizin nicht mehr wegzudenken. Neben dem Einsatz von Antikörpern bei der Behandlung einer Vielzahl verschiedener Krankheiten ist die Krebsbehandlung der wichtigste Anwendungsbereich. Zugelassene Antikörper haben alle den Nachteil, dass sie gegen tumorbezogene Antigene wirken, welche auf Tumorzellen überexprimiert sind, aber ebenfalls auf der Oberfläche gesunder Zellen vorkommen können. Aus diesem Grund können bei der Behandlung mit Antikörpern schwere Nebenwirkungen auftreten. Um die Risiken von Nebenwirkungen zu verringern, wurden verschiedene Ansätze verfolgt, darunter bispezifische, immunmodulatorische, pH-abhängige und proteaseaktivierbare Antikörper. Diese proteaseaktivierbare Antikörper werden später durch tumorassoziierte Proteasen aktiviert, die im gesunden Gewebe nur schwach exprimiert werden. Zusätzlich ist eine Maskierungsdomäne erforderlich. Diese Maskierungsdomänen können entweder aus Domänen bestehen, welche die Interaktion zwischen Antikörper und Antigen durch sterische Hinderung beeinträchtigen oder aus maßgeschneiderten, auf Affinität basierenden Maskierungsdomänen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um Maskierungsdomänen zu erhalten, welche von Haien abgeleiteten Einzeldomänenantikörpern (vNARs) und von Hühnern abgeleiteten single chain variable fragments (scFvs) basieren, die gegen verschiedene therapeutisch relevante Antikörper gerichtet sind. Im Falle der vNARs basierte ein Ansatz auf einem bestehenden vNAR, der gegen Matuzumab gerichtet ist und eine hemmende Wirkung auf die Matuzumab-EGFR-Interaktion zeigt. Das Einfügen von Histidinen in die CDR3 des vNAR führte zu einem pH-abhängigen Bindungsverhalten mit stark verminderter Affinität. Der Verlust der Affinität konnte weder durch einen SEED-basierten noch durch einen Fusionsansatz an die schwere oder leichte Kette überwunden werden. Die Maskierungseigenschaft ging in diesem Fall bei Fusion an die schwere oder leichte Kette mit Einbau einer Proteaseschnittstelle verloren. Ein weiterer Teil dieses Projekts zielte auf die de novo Isolierung von pH-abhängigen vNARs ab, die gegen Rituximab (Anti-CD20-Antikörper) und 5F9 (Anti-CD47-Antikörper) gerichtet sind. Die Isolierung von pH-abhängigen vNARs war für beide Antikörper erfolgreich. Zwei gegen 5F9 gerichtete vNARs wurden isoliert, während vier gegen Rituximab gerichtete vNARs erhalten wurden, von denen einer weiter charakterisiert wurde. Sowohl die gegen 5F9 gerichteten vNAR als auch der eine untersuchte vNAR gegen Rituximab zeigten Maskierungseigenschaften in Co-Inkubationsexperimenten des jeweiligen Antikörpers mit der jeweiligen Zielzelllinie. Während die Maskierungseigenschaften des gegen 5F9 gerichteten vNAR bei Fusion an den Antikörper nicht mehr beobachtet werden konnten, zeigte der gegen Rituximab gerichtete vNAR in SEED- und Leichte-Ketten-Konstrukten Maskierungseffekte. Der vNAR wurde über mehrere MMP-9-spaltbare Linker an die leichte Kette von Rituximab fusioniert. Im Falle der SEED-Konstrukte wurde eine pH-abhängige Wiederherstellung der Bindung beobachtet, während die Bindung der Leichte-Ketten-Fusionen nach MMP-9-Spaltung wiederhergestellt wurde. Im Falle einer weiteren untersuchten Leichte-Ketten-Fusion konnte der Maskierungseffekt im Leichte-Ketten-Konstrukt auf den Linker und nicht auf den vNAR selbst zurückgeführt werden. Das dritte Projekt im Rahmen dieser Arbeit zielte auf die Isolierung von Anti-Idiotyp-ähnlichen vNARs ab, die gegen einen T-Zell-Rezeptor (TCR) gerichtet sind. Während des Isolationsprozesses wurden vier vNARs erhalten, aber nur einer zeigte eine spezifische TCR-Bindung, während die anderen Varianten eine Bindung an konstanten Domänen zeigten. Das letzte Projekt im Rahmen dieser Arbeit zielte auf die Isolierung von anti-idiotypischen Hühnern scFvs aus einer Immunbibliothek ab, die auf der Immunisierung eines Huhns mit dem scFv des therapeutischen Antikörpers 6G11 (Anti-CD32b-Antikörper) basiert. Durch die Einbeziehung von CD32b in den Sortierungsprozess konnten scFvs isoliert werden, welche die Interaktion zwischen 6G11 und CD32b stören bzw. nicht stören. Die Fusion der scFvs aus dem Screening-Verfahren an die leichte Kette von 6G11 führte zu einer 2700-fachen Reduzierung der Bindung im Vergleich zum unmaskierten 6G11. Nach der Abspaltung des scFvs durch MMP-9 wurde die Bindung wiederhergestellt. Für eine weitere Wiederherstellung der Bindung war die teilweise Entfernung des scFv erforderlich.

German
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-265409
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 05 Feb 2024 13:01
Last Modified: 06 Feb 2024 07:42
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/26540
PPN: 515266299
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