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Peptide und Peptoide als Bindepartner für Chemokine

Wack, Julia Susanne (2024)
Peptide und Peptoide als Bindepartner für Chemokine.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00026504
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Peptide und Peptoide als Bindepartner für Chemokine
Language: German
Referees: Schmitz, Prof. Dr. Katja ; Kolmar, Prof. Dr. Harald
Date: 10 January 2024
Place of Publication: Darmstadt
Collation: ii, 136 Seiten
Date of oral examination: 23 January 2023
DOI: 10.26083/tuprints-00026504
Abstract:

Chemokine sind kleine Signalproteine des menschlichen Immunsystems, die wesentlich an der Steuerung und Regulierung von Entzündungsprozessen beteiligt sind. Außerdem spielen sie eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von chronisch entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunkrankheiten. Aus diesem Grund ist es von großem Interesse die Wechselwirkung der Chemokine mit ihren korrespondierenden Rezeptoren gezielt zu inhibieren. In diesem Zusammenhang sind Peptide und Peptidomimetika besonders interessant, da sie direkt aus der Rezeptorsequenz abgeleitet werden können. Eine Voraussetzung für die Identifikation von inhibierenden Sequenzen im Rezeptor ist ein genaues Verständnis der Interaktion zwischen Chemokin und Rezeptor. Der in der Literatur beschriebene Mechanismus der Chemokin-Rezeptor-Interaktion geht von einem zweistufigen Modell aus, bei dem es im ersten Schritt zu einem Kontakt des Rezeptor-N-Terminus mit einer Schleife am N-Terminus des Chemokins (site I) kommt. Daran schließt sich in einem zweiten Schritt die Interaktion des äußeren N-Terminus des Chemokins mit den extrazellulären Schleifen des Rezeptors (site II) an, wodurch es zur Rezeptoraktivierung kommt. Im Arbeitskreis wurde in einer früheren Arbeit ein Bindepeptid aus der site II-Bindestelle des Rezeptors CXCR1 für das inflammatorische Chemokin Interleukin-8 (CXCL8) entwickelt. Zur Kontrolle der Experimente wurde ein literaturbekanntes Peptid aus der site I-Bindestelle von CXCR1 genutzt. Neben ihrer Bindung an CXCL8 sind beide Peptide auch dazu in der Lage zelluläre Antworten auf das Chemokin CXCL8 zu inhibieren. Das erste Ziel dieser Arbeit war es die Bindung dieser Peptide an das Chemokin CXCL8 genauer zu untersuchen. Für CXCL8 ist die konzentrationsabhängige Ausbildung von Dimeren bekannt. Eine Vielzahl von Studien hat gezeigt, dass aus dem N-Terminus (site I) von CXCR1 abgeleitete Peptide mit einer hohen Affinität an monomere Varianten von CXCL8 binden, jedoch gegenüber dem Dimer nur eine geringe Affinität aufweisen. Dieses Verhalten konnte mit Hilfe von Fluoreszenzanisotropie-Messungen auch für das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte site I-Peptid CXCR1-p1 mit Hilfe der vorwiegend als Monomer vorliegenden Variante CXCL8 V27P/E29P und der über eine Disulfidbrücke kovalent zum Dimer verbundenen Variante CXCL8 R26C gezeigt werden. Die Bindung von CXCL8 an die site II Bindestelle des Rezeptors erfolgt primär über den unstrukturierten N-Terminus von CXCL8, der das ELR-Motiv enthält. Da der N-Terminus sowohl im monomeren als auch im dimeren Zustand von CXCL8 freiliegt wurde erwartet, dass monomere und dimere Varianten von CXCL8 mit der gleichen Affinität an die site II Bindestelle des Rezeptors binden. Ein experimenteller Beweis für diese Hypothese wurde bisher noch nicht erbracht. Während dieser Arbeit konnte mittels Fluoreszenzanisotropie-Messungen gezeigt werden, dass das site II-Peptid IL8RPLoops mit ungefähr der gleichen Affinität an die monomere Variante CXCL8 V27P/E29P wie auch an die dimere Variante CXCL8 R26C bindet, wodurch die Hypothese bestätigt werden konnte. Bindungsversuche mit einem Peptid aus den ersten zehn Aminosäuren des N-Terminus von CXCL8 und dem site II-Peptid IL8RPLoops bestätigten, dass der N-Terminus des Chemokins an der Bindung beteiligt ist, legten aber auch nahe, dass noch weitere Aminosäuren zu dieser Interaktion beitragen. Die Vermutungen über die Bindungsstelle für das site II-Peptid konnten also im Rahmen dieser Arbeit erstmalig experimentell untermauert werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss des Einbaus von Sulfotyrosin in die Sequenz des site I-Peptids CXCR1-p1 auf die Bindung an CXCL8 zu untersuchen, da für einige Chemokinrezeptoren bekannt ist, dass sie am N-Terminus sulfatiert vorliegen können und dass Chemokine in der Regel eine höhere Affinität zu ihren sulfatierten Rezeptoren aufweisen. Auch für CXCR1 wird eine Sulfatierung am N-Terminus vermutet. Außerdem konnte in Studien, die während der experimentellen Arbeiten zu dieser Dissertation publiziert wurden, gezeigt werden, dass CXCL8 Tyrosinsulfat bindet. Darum wurde das vom N-Terminus des CXCR1 abgeleitete site I-Peptid CXCR1-p1 in seiner am Tyrosin sulfatierten Form hergestellt. Mit Hilfe von Fluoreszenzanisotropie-Messungen konnte gezeigt werden, dass sich durch den Einbau von Sulfotyrosin die Affinität für CXCL8, im Vergleich zum nicht sulfatierten Peptid, um den Faktor 10 erhöht, was die Vermutung, dass CXCR1 ebenfalls sulfatiert vorliegt, bekräftigt. In einer vorausgehenden Dissertation im Arbeitskreis wurden cyclisierte und mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin (TAMRA)-markierte Varianten des site II-Peptids IL8RPLoops synthetisiert. In Fluoreszenzanisotropie-Messungen dieser cyclischen Peptide mit CXCL8 wurden inverse Bindungsisothermen erhalten. Die hohen Fluoreszenzanisotropiewerte legten nahe, dass der Fluorophor im ungebundenen Peptid stark in seiner Beweglichkeit eingeschränkt ist. Nach Bindung des cyclischen Peptids an das Chemokin CXCL8 wurden geringere Fluoreszenzanisotropiewerte gemessen, was auf eine Erhöhung der Beweglichkeit des Fluorophors hinweist. Eine mögliche Erklärung dieses Verhaltens ist, dass der über einen flexiblen Linker mit dem Peptid-Makrozyklus verbundene Fluorophor im ungebundenen Zustand mit dem Peptid interagiert und durch eine Bindung des Chemokins verdrängt wird. Auf diese Fluorophor-Peptid-Interaktion weisen auch MD-Simulationen hin. Um dieses ungewöhnliche Verhalten genauer zu beleuchten, wurden im Rahmen dieser Arbeit lineare mit TAMRA-markierte Varianten des site II-Peptids IL8RPLoops hergestellt und mittels Fluoreszenzanisotropie-Messungen die Bindung an CXCL8 untersucht. Die erhaltenen Bindungsisothermen zeigen den erwarteten, ansteigenden Verlauf, wobei auch hier für das ungebundene Peptid hohe Fluoreszenzanisotropiewerte gemessen wurden, die auf eine Interaktion des Fluorophors mit der Peptidstruktur hindeuten. Für lineare mit Fluorescein-markierte Varianten des site II-Peptids IL8RPLoops konnte dieses Verhalten nicht in dieser Ausprägung festgestellt werden. Diecyclischen Peptide haben entsprechend den Erwartungen in einem Proteasestabilitäts-Assay eine hohe Stabilität gegenüber dem Abbau durch das Enzym Trypsin gezeigt. Interessanterweise konnte hier auch für die linearen mit TAMRA-markierten Peptide eine Erhöhung der Proteasestabilität gezeigt werden, nicht jedoch für die mit Fluorescein-markierten. Dies deutet darauf hin, dass es durch die Interaktion zwischen TAMRA und der Peptidsequenz auch zu einer Stabilisierung der linearen Peptide kommt. Durch CD-Spektroskopie konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass die linearen, mit TAMRA-markierten Peptide keine Sekundärstrukturelemente ausbilden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass die Interaktion von TAMRA mit peptidbasierten Liganden nicht nur, wie bereits bekannt, zu Artefakten führt, sondern auch zur Stabilisierung von Peptiden beitragen kann. Der letzte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit Strategien, Peptide für den therapeutischen Einsatz besser nutzbar zu machen, da dieser nach wie vor durch bestimmte Nachteile, wie z.B. eine geringe Plasmahalbwertszeit durch den raschen Abbau durch Proteasen im Blut oder eine schnelle Ausscheidung über die Nieren aufgrund ihrer geringen Größe, limitiert ist. Um den proteolytischen Abbau von Peptiden zu unterbinden, können zum Beispiel die Cyclisierung, oder die Überführung der Peptidsequenz in ein sogenanntes Peptoid, ein N-substituiertes Oligoglycin, genutzt werden. Die rasche Ausscheidung über die Nieren kann verzögert werden, in dem durch das Anhängen bestimmter Peptidsequenzen oder hydrophober Anker die Bindung an Serumalbumin vermittelt wird. Ein weiteres Ziel der Arbeit war es daher Peptoidsequenzen zu finden, welche an humanes Serumalbumin (HSA) binden können. Dazu wurde im Zuge einer von mir betreuten Masterarbeit eine One-Bead-One-Compound (OBOC)-Bibliothek aus Peptoidhexameren synthetisiert und mittels fluoreszenzbasiertem Screening auf Binder für humanes Serumalbumin durchmustert. Dabei konnten in einem mehrstufigen Screening-Prozess 22 „Hits“ isoliert und mittels MALDI-TOF-MS-MS untersucht werden. Dabei konnten am Ende nur sechs Sequenzen eindeutig identifiziert werden. Diese Sequenzen wurden im Rahmen dieser Arbeit resynthetisiert und mittels Fluoreszenzanisotropie-Messungen auf ihre Bindung an HSA untersucht. Dabei konnte eine Bindung an HSA, im niedrigen mikromolaren Bereich, nur für einen „Hit“ nachgewiesen werden. Dies belegt, dass Peptoide grundsätzlich als proteasestabile HSA-Anker geeignet sind, mit denen die Plasmahalbwertszeit von Peptiden verlängert werden könnte. In einer Wiederholung des Screenings mit verbesserten Bedingungen zur Abspaltung des HSA sollten in zukünftigen Arbeiten mehr HSABindesequenzen aufgeklärt werden können, um eine Konsensussequenz für peptoidbasierte HSABinder zu erhalten.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Chemokines are small signaling proteins of the human immune system that are significantly involved in the control and regulation of inflammatory processes. They also involved in a large number of chronic inflammatory diseases and autoimmune diseases. Therefore it is of great interest to specifically inhibit the interaction of chemokines with their corresponding receptors. In this context, peptides and peptidomimetics are of particular interest as they can be derived directly from the receptor sequence. A prerequisite for the identification of inhibitory sequences in the receptor is a precise understanding of the interaction between chemokine and receptor. The mechanism of chemokine-receptor interaction described in literature is based on a two-step model in which the first step involves contact between the receptor N-terminus and a loop at the N-terminus of the chemokine (site I). This is followed in a second step by the interaction of the outer N-terminus of the chemokine with the extracellular loops of the receptor (site II), which leads to receptor activation. In a previous study a binding peptide from the site II binding site of the receptor CXCR1 for the inflammatory chemokine interleukin-8 (CXCL8) was developed. A peptide from the site I binding site of CXCR1 known from the literature was used as a control for the experiments. In addition to binding to CXCL8, both peptides are also able to inhibit cellular responses to the chemokine CXCL8. The first aim of this work was to investigate the binding of these peptides to the chemokine CXCL8 in more detail. CXCL8 is known to form dimers in a concentration-dependent manner. A number of studies have shown that peptides derived from the N-terminus (site I) of CXCR1 bind with a high affinity to monomeric variants of CXCL8, but have only a low affinity towards the dimer. Using fluorescence anisotropy measurements, this behavior could also be demonstrated for the site I peptide CXCR1-p1 investigated in this work using the variant CXCL8 V27P/E29P, which is predominantly present as a monomer, and the variant CXCL8 R26C, which is covalently linked via a disulfide bridge to form the dimer. The binding of CXCL8 to the site II binding site of the receptor occurs primarily via the unstructured N-terminus of CXCL8, which contains the ELR motif. Since the N-terminus is exposed in both the monomeric and dimeric states of CXCL8, it was expected that monomeric and dimeric variants of CXCL8 bind with the same affinity to the site II binding site of the receptor. Experimental evidence for this hypothesis has not yet been provided. During this work, fluorescence anisotropy measurements were used to show that the site II peptide IL8RPLoops binds with approximately the same affinity to the monomeric variant CXCL8 V27P/E29P as well as to the dimeric variant CXCL8 R26C, thus confirming the hypothesis. Binding experiments with a peptide consisting of the first ten amino acids of the N-terminus of CXCL8 and the site II peptide IL8RPLoops confirmed that the N-terminus of the chemokine is involved in the binding, but also suggested that other amino acids contribute to this interaction. The assumptions about the binding site for the site II peptide could therefore be experimentally substantiated for the first time in this work. A further aim of this work was to investigate the influence of the incorporation of sulfotyrosine into the sequence of the site I peptide CXCR1-p1 on binding to CXCL8, as it is known that some chemokine receptors can be sulfated at the N-terminus and that chemokines generally have a higher affinity for their sulfated receptors. CXCR1 is also thought to be sulfated at the N-terminus. In addition, studies published during the experimental work for this dissertation showed that CXCL8 binds tyrosine sulphate. Therefore, the site I peptide CXCR1-p1 derived from the N-terminus of CXCR1 was synthesized in its tyrosine sulfated form. Fluorescence anisotropy measurements showed that the incorporation of sulfotyrosine increases the affinity for CXCL8 by a factor of 10 compared to the non-sulfated peptide, which confirms the assumption that CXCR1 is also sulfated. In a previous dissertation cyclized variants of the site II peptide IL8RPLoops labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine (TAMRA) were synthesized. In fluorescence anisotropy measurements of these cyclic peptides with CXCL8 inverse binding isotherms were obtained. The high fluorescence anisotropy values suggested that the fluorophore in the unbound peptide is highly restricted in its mobility. After binding of the cyclic peptide to the chemokine CXCL8, lower fluorescence anisotropy values were measured, indicating an increase in the mobility of the fluorophore. A possible explanation for this behavior is that the fluorophore, connected to the peptide macrocycle via a flexible linker, interacts with the peptide in the unbound state and is displaced by binding of the chemokine. MD simulations also indicate this fluorophore-peptide interaction. In order to understand this unusual behavior, linear TAMRA-labeled variants of the site II peptide IL8RPLoops were synthesized and the binding to CXCL8 was investigated using fluorescence anisotropy measurements. The binding isotherms obtained show the expected increasing curve, whereby high fluorescence anisotropy values were also measured here for the unbound peptide, indicating an interaction of the fluorophore with the peptide structure. This behavior was not observed to this extent for linear fluorescein-labeled variants of the site II peptide IL8RPLoops. As expected, the cyclic peptides showed high stability against degradation by the enzyme trypsin in a protease stability assay. Interestingly, an increase in protease stability was also shown for the linear peptides labeled with TAMRA, but not for those labeled with fluorescein. This indicates that the interaction between TAMRA and the peptide sequence also leads to a stabilization of the linear peptides. CD spectroscopy also showed that the linear peptides labeled with TAMRA do not form secondary structure elements. This work has therefore shown that the interaction of TAMRA with peptide-based ligands not only leads to artefacts, as is already known, but can also contribute to the stabilization of peptides. The last part of the work investigated strategies to increase the usability of peptides for therapeutic use, as this is still limited by certain disadvantages, such as a short plasma half-life due to rapid degradation by proteases in the blood or rapid excretion via the kidneys due to their small size. In order to prevent the proteolytic degradation of peptides, cyclization or the conversion of the peptide sequence into a peptoid, an N-substituted oligoglycine, can be used, for example. Rapid excretion via the kidneys can be delayed by mediating binding to serum albumin by attaching certain peptide sequences or hydrophobic anchors. A further aim was therefore to find peptoid sequences that can bind to human serum albumin (HSA). For this purpose, a one-bead-one-compound (OBOC) library of peptoid hexamers was synthesized in the course of a supervised master thesis and screened for human serum albumin binders using fluorescence-based screening. In a multi-stage screening process, 22 "hits" were isolated and analyzed by MALDI-TOF-MS-MS. In the end, only six sequences could be clearly identified. These sequences were resynthesized and examined for their binding to HSA using fluorescence anisotropy measurements. Binding to HSA in the low micromolar range could only be detected for one "hit". This proves that peptoids are generally suitable as protease-stable HSA anchors that could be used to extend the plasma half-life of peptides. In a repetition of the screening with improved conditions for cleavage of the HSA, it should be possible to elucidate more HSA binding sequences in future work in order to obtain a consensus sequence for peptoid-based HSA binders.

English
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-265042
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 10 Jan 2024 13:12
Last Modified: 11 Jan 2024 12:59
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/26504
PPN: 514577126
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