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Epigenetic control of DNA replication dynamics in mammals

Casas Delucchi, Corella Susana :
Epigenetic control of DNA replication dynamics in mammals.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Epigenetic control of DNA replication dynamics in mammals
Language: English
Abstract:

One of the most critically important processes in any living organism, essential for development and reproduction, is that of the accurate replication of its genome before each cell division. The process of DNA replication can take place millions of times in a single organism and any mistake, if left unrepaired, is potentially transmitted into the next generation. Errors during replication can result in genetic mutations or karyotype aberrations, both of which can lead to disease or death. The duplication of the genome happens in a well-conserved spatio-temporal manner, a phenomenon implicated in development and disease. This fact indicates that DNA replication needs to be tightly regulated. Further, its precise coordination suggests that distinct genomic regions undergo replication at specific times during S-phase. On the other hand, the regulation of replication is a flexible process throughout development and is, therefore, proposed to be controlled epigenetically. However, the complexity of the mammalian nucleus has hampered the elucidation of how chromatin structure can regulate replication timing. In fact, our understanding of the regulation of replication timing in mammals is restricted to only a few studies with, in part, seemingly contradicting results. In the context of the present thesis, I set out to study the epigenetic mechanisms that control DNA replication dynamics in mammalian cells. To this end, I took advantage of the most prominent example of facultative heterochromatin, the epigenetically silenced X chromosome (Xi) of female mammalian cells, as well as of the mouse chromocenters, formed by clusters of constitutive heterochromatin. To study their particular replication dynamics and the epigenetic mechanisms controlling them, I used a set of genetic (conditional) knockouts, chemical inhibitory treatments and differentiation assays. The latter allowed me to control whole-chromosome inactivation and the subsequent establishment of the corresponding replication pattern, as well as to distinguish the contribution of different epigenetic markers in this process. I visualized the epigenetic changes and their effects on the replication program in situ by immunostainings, also in combination with fluorescence in situ hybridization (FISH), confocal and super resolution light microscopy, as well as in vivo by time-lapse microscopy over peri-ods of up to two days. This approach prompted the development of several tools for live-cell analysis. Using established and new tools, I comprehensively assessed the Xi replication dynamics and the effects of modulating different epigenetic modifications of heterochromatin, their cros-stalk and the subsequent effects on DNA replication timing and was able to show that histone hypoacetylation, a common mark of the Xi and chromocenters, is responsible for the delayed initiation in replication of both heterochromatic regions. Consequently, I propose that histone hyperacetylation, probably due to its opening effect on chromatin structure, renders some genomic regions prone to be bound by initiation factors earlier and / or more abundantly. This preferential binding, e.g. by replication initiation factors, would thus lead to earlier and concomitantly more efficient replication origin firing. Moreover, I discuss the causal relation between transcriptional inactivity and synchronous replication dynamics, a common feature of developmentally opposite systems, such as the mammalian Xi and the embryos of flies and frogs.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Einer der wichtigsten Prozesse in jedem lebenden Organismus, essenziell für Entwicklung und Fortpflanzung, ist die präzise Duplikation des Genoms vor jeder Zellteilung. Der Prozess der DNA Replikation kann millionenfach in einem einzigen Organismus stattfinden und jeder Defekt, wenn nicht repariert, kann an die nächste Generation weitervererbt werden. Fehler während der DNA Replikation können genetische Mutationen oder karyotypische Aberrationen verursachen, die zu Krankheiten bis hin zum Tod führen können. Die Duplikation des Genoms findet auf eine stark konservierte Weise statt und ihre Organisation spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der Entwicklung, als auch bei der Entstehung von Krankheiten. Dieses Phänomen deutet darauf hin, dass die DNA Replikation eng reguliert werden muss. Ferner suggeriert diese genaue Koordination, dass spezifische genomische Regionen an definierten Zeitpunkten der S-phase repliziert werden. Auf der anderen Seite ist die Regulation der Replikation ein flexibler Prozess, der sich entwicklungsbedingt verändern kann. Dies deutet darauf hin, dass die Replikation auf einer epigenetischen Ebene kontrolliert wird. Dennoch hat die Komplexität des Säugerkerns die Aufklärung der Mechanismen erschwert, bei denen die Chromatinstruktur die Replikationsdynamik regulieren kann. In der Tat beschränkt sich unser Verständnis über die zeitliche Regulierung der Replikation in Säugern bis dato auf sehr wenige Studien mit sich scheinbar widersprechenden Ergebnissen. Im Rahmen dieser Dissertation habe ich mich mit den epigenetischen Mechanismen auseinandergesetzt, die die DNA Replikationsdynamik in Säugerzellen kontrollieren. Zu diesem Zweck habe ich das bedeutendste Beispiel von fakultativen Heterochromatin genutzt, das epigenetisch inaktivierte X Chromosom (Xi) in weiblichen Säugerzellen, sowie Chromozentren aus Mauszellen, die durch Zusammenlagerung von konstitutivem Heterochromatin entstehen. Um die spezifische Replikationsdynamik dieser Regionen und die jeweiligen Kontrollmechanismen zu erforschen, habe ich konditionelle Knockout Zellen, chemisch inhibitorische Behandlungen und Differenzierungsuntersuchungen angewandt. Die Letzteren ermöglichten, die Inaktivierung eines ganzen Chromosoms und die Etablierung des darauffolgenden Replikationsmodus zu steuern. Ferner konnte ich hiermit den Beitrag der verschiedenen epigenetischen Markern in diesem Prozess bestimmen. Die epigenetischen Veränderungen in den verschiedenen Systemen, sowie die entsprechenden Effekte auf das Replikationsprogramm, habe ich mit verschiedenen Methoden visualisiert: in situ durch Immunofärbungen, auch in Kombination mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung, mit konfokaler und superauflösender Lichtmikroskopie, sowie in vivo mit Hilfe mikroskopischer Beobachtungen von lebenden Zellen über mehrere Tage. In diesem Rahmen veranlasste die Anwendung der o.g. Ansätze die Entwicklung mehrerer Werkzeuge für eine effizientere Lebendzellanalyse. Mittels etablierter und neuer Methoden habe ich eine umfangreiche Analyse der Xi Replikationsdynamik durchgeführt. Ich erforschte die Effekte von Manipulationen der epigenetischen Modifikationen von Heterochromatin und untersuchte potentiellen Crosstalk zwischen den verschiedenen Markern, sowie die Auswirkung auf das Replikationstiming der betroffenen Regionen. Ich konnte zeigen, dass die Histonacetylierung, eine gemeinsame epigenetische Modifikation des Xi und der Chromozentren, für die verzögerte Replikation beider heterochromatischen Regionen verantwortlich ist. Aus diesem Grund schlage ich vor, dass Histonacetylierung, vermutlich durch Erhöhung der Chromatinakzessibilität, bestimmte Regionen im Genom dafür anfällig macht, von Initiationsfaktoren früher und / oder besser gebunden zu werden. Die begünstigte Bindung durch z.B. Replikationsaktivierungsfaktoren, könnte demzufolge zu einer früheren und dabei effizienteren Aktivierung von Replikationsursprüngen führen. Weiter diskutiere ich die kausale Beziehung zwischen transkriptioneller Inaktivität und synchroner Replikationsdynamik, eine Gemeinsamkeit vom Säuger-Xi und den Embryonen von Fliegen und Fröschen, in der Entwicklung entgegengesetzten Systemen.German
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Jun 2011 09:50
Last Modified: 07 Dec 2012 12:00
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-26296
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina and Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed: 10 June 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2629
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