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Effekte unterschiedlicher Expressionsstrategien auf die Lipidmodifikation von rekombinantem OspA in Tabak

Hennig, Anna Carina :
Effekte unterschiedlicher Expressionsstrategien auf die Lipidmodifikation von rekombinantem OspA in Tabak.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Effekte unterschiedlicher Expressionsstrategien auf die Lipidmodifikation von rekombinantem OspA in Tabak
Language: German
Abstract:

Zur Produktion therapeutisch relevanter Proteine stellen Pflanzen als Bioreaktoren kostengünstige Alternativen zu den herkömmlich genutzten Produktionsplattformen tierischer und prokaryotischer Zellen dar. Eine wichtige Voraussetzung für die Funktionalität therapeutischer Proteine ist eine korrekte posttranslationale Modifikation innerhalb der Pflanzenzelle. Proteine mit großem therapeutischen Potential sind bakterielle Lipoproteine, die als Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs) vom Immunsystem erkannt werden und die Bildung reaktiver Antikörper stimulieren, wodurch sie erfolgreich als Impfstoffe gegen bakterielle Infektionskrankheiten genutzt werden können. Anhand des lipidierten bakteriellen Oberflächenproteins OspA des Spirocheten-Bakteriums Borrelia burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose, konnte bereits gezeigt werden, dass Pflanzen zur Lipidmodifikation bakterieller Proteine fähig sind (Glenz et al., 2006). Transplastome Tabakpflanzen akkumulierten dabei eine lipidierte Form von OspA bis zu 1% des LGP, wobei die resultierende Lipidmodifikation im Chloroplasten unvollständig verlief. Wie sich in der vorliegenden Arbeit herausstellte, konnte die Proteinakkumulation von rekombinantem plastidärem OspA (rpOspA) in transplastomen Pflanzen durch einen alternativen Integrationsort im Chloroplastengenom von 1% auf 10%- 20% des LGP gesteigert werden und das zur Lipidierung nötige minimale Sequenzmotiv bestimmt werden. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass das Cystein an Position +1 innerhalb der N-terminalen Signalsequenz eine zur Lipidmodifikation essentielle Aminosäure darstellt. Weiter konnte dargelegt werden, dass rpOspA in Abhängigkeit der zur Lipidierung notwendigen bakteriellen Signalsequenz in Assoziation zu den Membranen des Thylakoidsystems vorliegt und diese Lokalisation unabhängig von einer vorhandenen Lipidierung des Proteins erfolgt. Als Folge der Lokalisation des rekombinanten Proteins an den photochemisch aktiven Membranen konnte eine Störung des photosynthetischen Apparats und ein damit verbundener Vitalitätsverlust transplastomer Pflanzen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu war in Abwesenheit einer Volllängesignalsequenz die Akkumulation einer nicht lipidierten Variante im plastidären Stroma bis zu einem Gehalt von 20% des LGP erhöht, ohne die Vitalität der Pflanzen zu beeinflussen. Neben der sterischen Inhibierung photochemisch aktiver Membranen konnte zudem ein negativer Effekt der Präsenz der bakteriellen Signalsequenz auf die Proteinstabilität beobachtet werden, der zu einer mangelnden Akkumulation des rekombinanten Proteins führte. Dieser Effekt konnte für weniger Protease-resistente Proteine wie YFP beobachtet werden, wobei eine Stabilisierung durch eine Fusion an das Protease- resistente OspA erzielt werden konnte. Neben den inhibitorischen Effekten der bakteriellen Signalsequenz von OspA auf Proteinakkumulation und Pflanzenvitalität transplastomer Pflanzen konnte auch unter Verwendung eines transienten Expressionssystems ein negativer Einfluss der bakteriellen Lipidierungssequenzen auf die Proteinakkumulationsrate festgestellt werden. Dieser war im Gegensatz zur plastidären Expression unabhängig vom Protease-resistenten Charakter des zu synthetisierenden Proteins. Ein Entfernen oder Verkürzen der N-terminalen Signalsequenz resultierte für beide Produktionssysteme in einer gesteigerten Proteinakkumulation. Aufgrund dieser Ergebnisse scheint eine effektive Produktion bakterieller Lipoproteine im Bioreaktor Pflanze daher zunächst nicht gegeben. Immunologische Untersuchungen an Mäusen zeigten jedoch, dass eine orale Applikation von transgenem OspA-Pflanzenmaterial, unabhängig vom Lipidierungsstatus des rekombinanten Proteins, zu einer Bildung reaktiver Antikörper führte. Im Falle einer Applikation von transgenem Pflanzenmaterial ist damit die Lipidierung von OspA für den therapeutischen Nutzen nicht zwingend erforderlich, so dass eine effektive Produktion einer OspA-Variante ohne bakterielle Signalsequenz in transplastomen Pflanzen kostengünstig erfolgen kann.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In comparison with commonly used production systems like animal or prokaryotic cells, plants resemble a cheap production platform for recombinant proteins. When used as therapeutics the correct posttranslational modification of the recombinant proteins within the plant cell is an essential factor with great influence on the protein’s proper physiological function. Bacterial lipoproteins belong to the family of so called pathogen associated molecular patterns (PAMPS) and are highly immunogenic. Because they are easily recognized by the host’s immune system yielding in the production of reactive antibodies, they can successfully be used as vaccines against bacterial infectious diseases. A prominent example is the outer membrane protein A (OspA) of the spirochete bacterium Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme-disease. The production of OspA inside the chloroplasts of transplastomic tobacco plants gave proof that plants are capable of posttranslational lipid modification due to bacterial signal sequences (Glenz et al., 2006), although the lipid modification is not identical to that found in bacterial cells. The fraction of recombinant plastidal OspA in transplastomic plants reached 1% of total soluble protein. In the present study the accumulation level of recombinant OspA in transplastomic tobacco plants could be increased up to 10%-20% of TSP by usage of an alternative expression site within the chloroplast’s genome. Beside the identification of the minimum signal sequence that is required for protein lipidation within the chloroplast it could be shown that the cystein residue at position +1 within the bacterial signal sequence is as essential for lipid modification in bacterial cells as in plastids. Due to the presence of the full length signal sequence the protein was found to be attached to the thylakoid membranes and this was independent of the lipidation status of the protein. As a result of the localization at photosynthetic active membranes inhibition of PS II function could be detected, leading to a reduced viability of transplastomic plants. However, in the absence of the bacterial full length signal sequence protein accumulation of an unlipidated form of OspA reached 20% of TSP without interfering with photosynthetic functions or reduction of plant viability. Additional to the steric interference in photosynthetic membranes the full length signal sequence was also found to have negative influence on protein stability yielding in low protein accumulation levels. This effect was reported for less stable proteins like YFP. Nevertheless the stability of YFP could be maintained by fusion to the protease resistant protein OspA. Beside the effects of the bacterial signal sequence on protein stability and plant viability, which were detected for transplastomic plants some negative influence of the bacterial signal sequence related to the protein accumulation level could also be shown in transient expression experiments. In contrast to transplastomic plants this effect was independent of the protease resistant nature of the protein. For both expression systems the deletion or truncation of the bacterial signal sequence resulted in an increased protein accumulation level. Due to these results it is obvious that reasonable expression of bacterial lipoproteins using plants as production platform is not feasible. However, immunological studies with mice revealed that oral application of plant material harbouring a truncated, non-lipidated form of OspA elicits a specific immune response. Taken together this result indicates that the lipid modification of OspA is not mandatory to induce specific antibodies after oral immunization and that the plant matrix might have additional adjuvant activity.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 27 Jun 2011 12:29
Last Modified: 07 Dec 2012 12:00
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-26193
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Warzecha, Prof Heribert and Thiel, Prof Gerhard
Refereed: 6 May 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2619
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