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Promotoranalyse des gehirnspezifisch exprimierten Gens 83.5

Perl, Sabine :
Promotoranalyse des gehirnspezifisch exprimierten Gens 83.5.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2002)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Promotoranalyse des gehirnspezifisch exprimierten Gens 83.5
Language: German
Abstract:

In unserem Arbeitskreis wurde auf der Suche nach Blut-Hirn-Schranke spezifischen Expressionsprodukten zwei bisher noch nicht beschriebene mRNA-Sequenzen (tmp 83.5 und sp 83.5) isoliert. In situ Hybridisierungen und immunhistochemische Untersuchungen zeigten, dass beide Transkripte in unterschiedlichen Neuronentypen der Groß- und Kleinhirnrinde des Schweins gebildet werden. Die Transkripte codieren höchstwahrscheinlich für ein noch nicht beschriebenes potenzielles Transmembranprotein (TMP 83.5) sowie für dessen lösliche Isoform (SP 83.5). Die mRNA-Sequenzen werden von einem 21,7 kb langen Gen (Gen 83.5) unter der Nutzung alternativer Promotoren gebildet. Interessanterweise existiert zu dem porcinen Gen 83.5 eine humane Genvariante sowie eine korrespondierende mRNA tmp 83.5. Das humane Gen HTMP10 ist auf Chromosom 10 in einem Bereich lokalisiert, der im engen Zusammenhang mit neuronalen Fehlfunktionen steht. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst der Transkriptionsstartpunkt des Transkripts sp 83.5 in Primer Extension Analysen bestimmt. Die computergestützte Sequenzanalyse der resultierenden Promotorregion ergab, das diese zahlreiche Bindungsstellen neuronaler und gehirnspezifischer Transkriptionsfaktoren enthält. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Promotor tmp 83.5 analysiert. Zum Nachweis funktioneller regulatorischer Sequenzelemente im Promotor tmp 83.5 sowie in der 5`-nichttranslatierten Region (5`-UTR) wurde eine Serie von Promotortestplasmiden mit zunehmenden 5`-Deletionen des Wildtyp-Promotors tmp 83.5 generiert. Die Expressionsraten dieser Promotorvarianten wurden in neuronalen Zellinien sowie im Vergleich hierzu in einer nichtneuronalen Zellinie untersucht. Mit den Ergebnissen dieser Deletionsstudien konnten verschiedene funktionelle Bereiche im Promotor eingegrenzt werden, die für eine zellspezifische bzw. allgemeine Aktivierung respektive Repression des Gens 83.5 verantwortlich sind. Mit DNase I Footprinting- und Band Shift-Analysen konnten in vitro sequenzspezifische Protein-Bindungen im Bereich des Kern- und proximalen Promotors tmp 83.5 nachgewiesen werden. Anhand der erhaltenen Ergebnisse wurde ein Modell für die Regulation des Promotors tmp 83.5 aufgestellt. Es umfasst neben einen ubiquitären Enhancer in der 5’-nichttranslatierten Region einen neuronspezifischen Aktivator und Repressor im distalen Promotor sowie Bindungsstellen für induzierbare und neuronspezifische Transkriptionsfaktoren im proximalen Promotor.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In search of blood-brain-barrier specific expression products our group has isolated two previously unknown mRNA sequences (tmp 83.5 and sp 83.5). In situ hybridisations and immunohistochemical studies showed that both transcripts appear in different neural cell types in the pig cerebrum and cerebellum. The transcripts encodes most likely for a membrane protein (TMP 83.5) and its soluble isoform (SP 83.5). Alternative promoter usage of single-copy gene 83.5 (21,7 kb) generates these mRNA isoforms. Interestingly a human variant to the gene 83.5 as well as a corresponding mRNA tmp 83.5 exist. The human gene HTMP10 is localized within a genomic region of chromosome 10, which can be related to neural dysfunctions. In this work the transcription start site of the transcript sp 83.5 has been determined by primer extension studies. The computer based sequence analysis of the resulting promoter region showed numerous binding sites for neural and brain-specific transcription factors. Furthermore the promoter region of tmp 83.5 was analysed. In proof of functional sequence elements within the promoter tmp 83.5 as well as within the 5`-untranslated region (5`-UTR) a series of 5`-deletions of the wild type promoter was generated. The expression rates of these promoter variants were studied in neural and non-neural cell lines. That way various functional regions were detected which are responsible for cell-specific activation and repression of the gene 83.5. Using DNase I Footprinting- and Band Shift-analysis sequence-specific binding of several DNA binding proteins within the core- and proximal promoter tmp 83.5 were demonstrated. With these results a model for the regulation of the promoter tmp 83.5 was compiled. The identified functional elements are a ubiquitous enhancer in the 5`-UTR and a neural-specific activator and repressor in the distal promoter as well as binding sites for inducible and neuron-specific transcription factors in the proximal promoter.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: Fachbereich Chemie
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:21
Last Modified: 09 Dec 2012 09:47
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000251
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-2510
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Friedl, Prof. Dr. Peter
Advisors: Gassen, Prof. Dr. Hans Günter
Refereed: 13 May 2002
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/251
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