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Untersuchungen zur genetischen Stabilität von normalen humanen Fibroblasten nach Einwirkung von dicht-ionisierender Strahlung

Zahnreich, Sebastian :
Untersuchungen zur genetischen Stabilität von normalen humanen Fibroblasten nach Einwirkung von dicht-ionisierender Strahlung.
Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Untersuchungen zur genetischen Stabilität von normalen humanen Fibroblasten nach Einwirkung von dicht-ionisierender Strahlung
Language: German
Abstract:

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der genotoxischen Wirkung dicht-ionisierender Strahlung in den Nachkommen bestrahlter humaner Fibroblasten. Dabei sollte insbesondere die Entwicklung der genomischen Stabilität über die in vitro Lebensspanne untersucht werden, die in diesem Zelltyp durch beschleunigte Differenzierung und frühzeitigen Eintritt in die Seneszenz gewährleistet wird. Um zellspezifische Entwicklungen besser abschätzen zu können, wurde zuerst die Langzeit-entwicklung verschiedener Fibroblasten (Haut, Lunge, Vorhaut) ohne die Einwirkung ionisie-render Strahlung charakterisiert. Zusammen mit Ergebnissen aus Vorarbeiten (Fournier et al. 2007) zeigte sich, dass in allen untersuchten Fibroblasten genomische Instabilität auftreten kann. Als eine typische Entwicklung von Fibroblasten hat sich eine mit dem Alter der Kultur zunehmende klonale Expansion von Zellen mit chromosomalen Aberrationen erwiesen. In einem Experiment (Haut) kam es zu Monosomien, insbesondere für Chromosom 6, die mit einer verlängerten replikativen Lebensspanne und deutlicher genomischer Instabilität einher-ging. Eine interessante Beobachtung war, dass im Laufe der Kultivierung spontan stark ver-kürzte Telomere oder Brüche in der Telomerregion einzelner Chromosomen auftraten. Be-sonders deutlich zeigte sich in Fibroblasten der Lunge, dass dabei das instabile Telomer eines Chromosoms durch Duplikationen terminaler Fragmente verschiedener Donorchromosomen wieder stabilisiert wurde. Ein solcher Mechanismus wurde in Hefe- und Tumorzellen als „break-induced replication“ beschrieben, aber in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal in normalen humanen Zellen als spontanes Ereignis beobachtet. Es ist zu vermuten, dass es sich hierbei um ein wichtiges Element zum Erhalt der genomischen Stabilität in Fibroblasten handelt. Im Rahmen der Untersuchungen des genetischen Risikos für die Nachkommen von bestrahl-ten Fibroblasten zeigte sich, dass eine Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies innerhalb weniger Tage nach Bestrahlung auftrat und dann wieder zurückging. Die Zunahme intrazellu-lärer reaktiver Sauerstoffspezies geht auf strahleninduzierte Veränderungen des Zellmetabo-lismus zurück und verursacht chronische Schäden an der DNA und anderen Strukturen. Ein erneuter Anstieg in alternden Zellen wurde zwar festgestellt, dieser war aber unabhängig von einer vorherigen Bestrahlung und stand in keinem zeitlichen Zusammenhang zum Auftreten genomischer Instabilität. Dies zeigt, dass antioxidative Mechanismen in Fibroblasten bei aku-ter Schädigung durch Bestrahlung sehr wirksam sind und ebenfalls zur genomischen Stabilität der Zellen beitragen. Dieser Arbeit vorangegangene Experimente haben gezeigt, dass genomische Stabilität in den Nachkommen bestrahlter Fibroblasten vor allem durch frühzeitige Differenzierung und Übergang in die replikative Seneszenz gewährleistet wird. Trotzdem wurden massive geno-mische Instabilität und Veränderungen der Zellzyklusregulierung nach Bestrahlung mit hohen Dosen von Röntgenstrahlung, häufig in klonal expandierenden Zellen mit chromosomalen Aberrationen beobachtet. In der vorliegenden Arbeit sollte daher untersucht werden, wie sich im Vergleich zur Bestrahlung mit Röntgenstrahlung die Bestrahlung mit dicht-ionisierenden Kohlenstoff-Ionen auswirkt. Nach gezielter Bestrahlung aller Zellen mit einer definierten Anzahl (1 oder 5 Treffer) von Kohlenstoff-Ionen [4,8 MeV/u] an der Mikrosonde der GSI konnte festgestellt werden, dass nach Durchgang eines einzelnen Kohlenstoff-Ions 70 % der Zellen im ersten Zellzyklus nach Bestrahlung chromosomale Schäden zeigten. 20% der Zellen überlebten klonogen und in 30% dieser Zellen wurden vererbbare strahleninduzierte Aberrationen stabil an die direkten Nachkommen weitergeben. Zwar trat in den Nachkommen bestrahlter Zellen chromosomale Instabilität auf, das Ausmaß in Kontrollzellen wurde aber nicht überschritten. Die Zellzyklus-regulierung war von der vorherigen Bestrahlung unbeeinflusst. Allerdings zeigte sich in den Nachkommen der gezielt mit Kohlenstoff-Ionen bestrahlten Zellen ein im Vergleich zu Kont-rollen verfrühter Übergang zu terminalen Differenzierungsstadien und Seneszenz. Dies könnte ein Grund dafür sein, dass das Ausmaß genomischer Instabilität in diesen Zellen das Niveau von Kontrollzellen nicht übersteigt. Auch ist die Wahrung der genomischen Integrität durch verfrühten Übergang zu terminalen Differenzierungsstadien und Seneszenz effizienter als für Röntgenstrahlung, wenn man physikalische Dosen von Kohlenstoff-Ionen und Rönt-genstrahlung vergleicht, die in Zellen direkt nach einer Bestrahlung ähnliche Effekte hervor-rufen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The purpose of the present study was to investigate genotoxic effects of densely ionizing radiation in the descendants of irradiated human fibroblasts. Especially the genomic stability during the in vitro lifespan was examined which is ensured by accelerated differentiation and premature senescence in fibroblasts. To assess differences in the long-term development of fibroblast strains, long-term cultures of three non-irradiated strains form different tissues of origin (skin, lung and foreskin) were analyzed. Including results from preceding works (Fournier et al. 2007), in all fibroblasts strains genomic instability was observed. Another typical cytogenetic feature of fibroblasts, clonal expansion of cells carrying chromosomal aberrations, occurred over the time of cultur-ing. Monosomies developed (e.g. for chromosome 6) together with a prolonged life-span and severe genomic instability in one experiment (skin). Furthermore, considerably shortened telomeres or breaks in the telomeric region of single chromosomes occurred spontaneously during the period of culturing. As shown for lung fibroblasts, dysfunctional telomeres of a sin-gle chromosome were stabilized by duplications of terminal fragments of multiple donor-chromosomes. Such a phenomenon (“break-induced replication”) has been described in yeast and tumor cells and, for the first time in the work at hand, in normal human cells. This mechanism may represent an important element to preserve chromosomal stability in fibro-blasts. In the context of investigations concerning the genetic risks in the progeny of cells exposed to densely-ionizing radiation, an accumulation of reactive oxygen species (ROS) was shown during the first days after irradiation followed by a decrease to the level of controls. This early radiation-induced accumulation of ROS goes back to alterations of the cellular metabolism and causes chronic damage to DNA and other cellular structures. An increase in in vitro aged fibroblasts was observed independent of a previous radiation exposure and in no temporal relation to genomic instability. Thus, anti-oxidative safeguard mechanisms are activated and effective after acute radiation-damage and contribute to the genomic stability of fibroblasts. Former experiments showed that genomic stability is assured by premature differentiation and senescence in the descendants of irradiated fibroblasts. Nevertheless, severe genomic instability and impaired cell-cycle regulation was observed after irradiation with high doses of X-rays and frequently in clonally expanding cells carrying chromosomal aberrations. The aim of this study was to determine the different consequences of the exposure to densely-ionizing radiation compared to X-rays. After targeted irradiation with a defined number (1 or 5 hits) of carbon-ions [4,8 MeV/u] at the microbeam facility at GSI, we could show that after the traversal of a single carbon-ion 70 % of the cells reaching the first cell-cycle showed chromosomal aberrations. 20 % of the trav-ersed cells survived clonally and in 30 % of these cells transmissible radiation induced aber-rations were passed to the clonal descendants. Although chromosomal instability occurred in the descendants of irradiated cells, the level of control cells was not exceeded. The regulation of the cell-cycle was not affected. However, the progeny of carbon-ion [4.8 MeV/u] irradiated cells underwent earlier differentiation and senescence compared to controls. This could be an important factor limiting the emergence of genomic instability in the progeny of cells irradiated with carbon-ions, not exceeding the level of controls.These results indicate that the protection of the integrity of the genome by premature differentiation and senescence seems to be more efficient when comparing physical doses of carbon-ions and X-rays, which in contrast lead to similar direct effects after irradiationEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 18 Mar 2011 10:04
Last Modified: 07 Dec 2012 11:59
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-24863
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Durante, Prof. Dr. Marco and Löbrich, Prof. Dr. Marcus and Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Dencher, Prof. Dr. Norbert A.
Refereed: 25 February 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2486
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