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Transglutaminase-mediierte Serotonylierung neuronaler und glialer Proteine

Hummerich, René :
Transglutaminase-mediierte Serotonylierung neuronaler und glialer Proteine.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Transglutaminase-mediierte Serotonylierung neuronaler und glialer Proteine
Language: German
Abstract:

Im Zentralen Nervensystem (ZNS) spielt Serotonin (5-HT) eine entscheidende Rolle, sowohl als Neurotransmitter, als auch bei der neuronalen Entwicklung, der Synaptogenese, der neuronalen Plastizität inklusive Zellwanderung und Zellkontakt-Formation. Serotonin ist beteiligt an der Steuerung der Stimmungen, von Emotionen, Schlaf und Appetit, so wie an der Kontrolle des Verhaltens und an einer Vielzahl von physiologischen Funktionen. Im Vergleich zu anderen Neurotransmittersystemen, ist das serotonerge System am komplexesten und expansivsten aufgebaut. Serotonerge Neurone vermitteln Effekte sowohl an den Synapsen, als auch parakrin über extrasynaptische, axonale und somatodendritische Freisetzung. Die Effizienz der serotonergen Signalübertragung, d.h. der Konzentration von extrazellulärem 5-HT, wird direkt kontrolliert über die Wiederaufnahme in die serotonergen Zellen durch den Serotonintransporter (SERT). Außerhalb des ZNS dient Serotonin im Blutserum als Vasoconstrictor; synthetisiert in den enterochromaffinen Zellen des Gastrointestinaltrakts wird es von Thrombozyten aufgenommen. Der Kontakt von Thrombozyten mit verletztem Gewebe führt zur Freisetzung von 5-HT gefolgt von Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten. Serotonin wird hierbei kovalent an prokoagulierende Proteine transamidiert und ist somit direkt beteiligt an der Blutgerinnung. Dieser Prozess wird durch Transglutaminase vermittelt und als Serotonylierung bezeichnet. Die serotonylierten Proteine interagieren mit spezifischen 5-HT Bindungsstellen auf Fibronektin und Thrombospondin und bilden so stabile extrazelluläre, multivalente Komplexe, welche notwendig sind für die Thrombusbildung. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Transglutaminase-mediierte kovalente Inkorporation von Monoaminen auch an neuralen Proteinen möglich ist und welche Auswirkungen sie auf die Expression von extrazellulären Proteinen hat. Die Ergebnisse zeigten, dass [3H]-Serotonin sowohl durch endogene- als auch recombinante TGase, an Mausgehirn Homogenat transamidiert wurde. Diese Serotonylierung wurde spezifisch durch Cystamin und Monodansylcadaverin inhibiert. Vermittelt durch recombinante TGase2 wurden extrazelluläre- und Zelloberflächen-Proteine von C6 Gliomazellen spezifisch mit [3H]-Serotonin transamidiert, auch diese Serotonylierung wurde durch Cystamin inhibiert und dosisabhängig durch unmarkiertes 5-HT verdrängt. Die Transglutaminase-mediierte Transamidierung von unmarkiertem Serotonin bei C6 Gliomazellen führte zu Induktion von Proteinaggregaten an der Zelloberfläche und zwischen den Zellen. Bei diesen Proteinaggregaten handelte es sich um multivalent verknüpfte extrazelluläre Proteinnetzwerke bestehend aus serotonylierten Proteinen und den zugehörigen Bindungsproteinen. Gleichermaßen zeigte sich, dass die Transamidierung von 5-HT eine wachstumsfördernde und protektive Wirkung gegenüber zellschädigenden Außeneinflüssen hat. Zur Visualisierung dieser Proteinnetzwerke wurde das autofluoreszierende, serotoninanaloge 5,7-Dihydroxytryptamin, sowie Monodansylcadaverin (MDC) spezifisch an lebende C6 Gliomazellen transamidiert. Die elektrophoretische Auftrennung der mit MDC inkorporierten C6 Zellproteine zeigte mehrere fluoreszierende, distinkte Proteinbanden. Eines dieser Zielproteine der TGase mediierten Transamidierung konnte als Fibronektin identifiziert werden. Die spezifische Transamidierung von Fibronektin mit tritiiertem Serotonin, Noradrenalin und Dopamin erbrachte, dass es außer der Serotonylierung auch noch Noradrenalinylierung und Dopaminylierung gibt, also einen allgemeinen Mechanismus der Monoaminylierung. Die Ergebnisse vermitteln eine neue Funktion von Monoaminen im ZNS, nicht mehr nur als Neurotransmitter, sondern als wichtiger Bestandteil des Aufbaus und der Stabilisierung von Zellen. Die Transglutaminase-mediierte Transamidierung von extrazellulären Proteinen des ZNS, sezerniert sowohl durch Neurone, aber vor allem durch Gliazellen, spielt eine entscheidende Rolle im Aufbau und der Stabilisierung der Extrazellulären Matrix (EZM). Monoamine dienen somit als eine Form von biologischem Kleber („neural glue“), notwendig für die Formation von Proteinnetzwerken, wie es bisher nur für das TGase vermittelte „Crosslinking“ von Proteinen beschrieben war. Die Funktionen der Monoaminylierung für den Aufbau der EZM, als „cross-linker“ zwischen Neuronen- und Glia, nimmt hierdurch auch Einfluss auf die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Formation und ihre Interaktion. Die Transamidierung von extrazellulären Proteinen kann somit bei der Stabilisierung bestehender Synapsen, der Synaptogenese, Axonsprossung und schlussendlich auch für die neuronale Plastizität eine wichtige Rolle spielen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In the central nervous system serotonin (5-HT) plays important roles as a neurotransmitter as well as during development, synaptogenesis and neuronal plasticity including cell migration and cell formation. Serotonin is known to modulate mood, emotion, sleep and appetite and is implicated in the control of numerous behavioural and physiological functions. Compared to other neurotransmitter systems, the 5-HT system is the most complex and expansive. Serotonergic neurons produce their effects at synapses as well as paracrine via extrasynaptic axonal and somatodendritic release. The efficiency of serotonergic signalling, i.e. the concentration of extracellular 5-HT is directly controlled by its reuptake back into serotonergic neurons through the serotonin transporter (SERT). Outside of the central nervous system, in the blood serum, serotonin serves as a vasoconstrictor, synthesized in enterochromaffin cells of the gastrointestinal tract and taken up into blood platelets. Contact of platelets to a site of vascular injury leads to release of 5-HT followed by platelet adhesion and aggregation. Serotonin is then covalently transamidated to procoagulant proteins of hemostasis. This process is mediated by transglutaminases (TGase) and named “serotonylation”. Serotonin-conjugated proteins then interact with their respective serotonin binding sites on fibrinogen and thrombospondin to form stable extracellular multivalent complexes thereby promoting thrombus generation. In the present study, I have investigated whether transglutaminase-mediated transamidation can also covalently incorporate monoamines to neural proteins and whether this might affect extracellular protein expression. The data revealed that [3H]-serotonin is specifically transamidated to mouse brain homogenates by endogeneous as well as recombinant transglutaminases and this serotonylation is inhibited by the transglutaminase inhibitor cystamine and monodansylcadaverine. Moreover, [3H]-serotonin was specifically transamidated to extracellular and cell-surface proteins from C6 glioma cells. This process was inhibited by cystamine and dosis dependently displaced by unlabelled 5-HT. The transglutaminase-mediated transamidation of unlabelled serotonin to C6 cells induced an aggregation of extracellular protein matrices adjacent to and between single cells. These protein aggregations reflect multivalent cross-linked extracellular protein matrices of serotonylated proteins and their respective binding proteins. The transamidation of 5-HT to protein promoted cell growth and effected in a cell protective manner. For visualization of these protein networks, living C6 cells were specifically transamidated with the autofluorescent serotonin analogue 5,7-dihydroxytryptamine and monodansylcadaverine (MDC). Elektrophoretic separation of MDC-labeled C6 cell protein revealed several distinct fluorescent proteins and one of which was identified as fibronectin. The specific transamidation of tritiated serotonin, noradrenalin and dopamine to fibronectin resulted in the finding, that in addition to serotonylation, noradrenalinylation and as well as dopaminylation, also a ubiquitous mechanism of monoaminylation exists. These results indicate a new function of monoamines in the central nervous system, not only as neurotransmitter, but also as an important component of construction (structure) and stabilization of cells. The transglutaminase-mediated transamidation of extracellular proteins of the CNS, expressed in neurons as well as glial cells, plays an important role in building and stabilization of the extracellular matrix (ECM). Thus, monoamines may act as a form of “neural glue”, necessary for the formation of protein networks, as described before only for the transglutaminase-mediated “cross-linking” of proteins. The function of monoaminylation for construction of the ECM and as cross-linker between neurons and glial cells is also important for cell-cell- and cell-matrix-formation and their interaction. Where the transamidation of extracellular proteins may be involved in stabilization of synapses, synaptogenesis, axon sprouting and consequently it may play an important role in neural plasticity.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology > Zoology > Neuropharmacology
Date Deposited: 01 Feb 2011 07:21
Last Modified: 07 Dec 2012 11:59
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-24096
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Schloss, Prof. Dr. Patrick
Refereed: 27 January 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2409
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