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Vectors for Algernon: Receptor-Targeted Lentiviral and Adeno-Associated Vectors in Syngeneic Mouse Models of In Vivo Gene Therapy

Michels, Alexander (2023)
Vectors for Algernon: Receptor-Targeted Lentiviral and Adeno-Associated Vectors in Syngeneic Mouse Models of In Vivo Gene Therapy.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00024076
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Vectors for Algernon: Receptor-Targeted Lentiviral and Adeno-Associated Vectors in Syngeneic Mouse Models of In Vivo Gene Therapy
Language: English
Referees: Nuber, Prof. Dr. Ulrike ; Buchholz, Prof. Dr. Christian J.
Date: 2023
Place of Publication: Darmstadt
Collation: xiii, 123 Seiten
Date of oral examination: 31 May 2023
DOI: 10.26083/tuprints-00024076
Abstract:

Driven by recent leaps in receptor targeting technology, advanced vector platforms are currently reshaping gene therapeutic strategy, promising to enable a new generation of accessible, safe and unprecedentedly effective products. Their transformative potential has been impressively demonstrated by recent preclinical reports describing the in vivo generation of chimeric antigen receptor (CAR) T cells in short-term mouse models. Beyond proof-of-principle, however, important questions remain, many of them motivated by an insufficient understanding of the host immune response to vector administration, which will likely critically impact the products’ real-world safety and efficacy. Toward a better understanding of the host response, syngeneic mouse models - capable of recapitulating the response of a complete, complex mammalian immune system to vector administration - can helpfully complement the existing body of work on humanized models and enable the thorough preclinical examination of vector-host interplay which is warranted by the tumultuous history of clinical gene therapy research. Such models require surrogate reagents, which have so far been unavailable for certain classes of receptor-targeted vectors, especially viral vectors. This thesis describes the generation and characterization of such mouse-compatible viral vectors, as well as their use in the syngeneic mouse models of in vivo gene therapy they enable. Lentiviral vectors targeted to CD8+ and CD4+ murine lymphocytes (mCD8- & mCD4-LVs) were generated by insertion of anti-mCD8α MSE10 designed ankyrin repeat protein (DARPin) and anti-mCD4 GK1.5 single chain variable fragment, respectively, into the blinded measles virus pseudotype pioneered by the host lab- oratory. Crucially, in spite of the well-documented, multicausal inability of LVs’ infamous parent virus HIV-1 to productively infect murine cells, the introduction of mouse receptor-targeted binders was sufficient to confer mouse-compatibility to the particles, which displayed transducing titers on primary mouse splenocytes similar to those observed for hCD8- and hCD4-LVs on human T cell lines. Additionally, binder insertion rendered mCD4- and mCD8-LV highly selective for cells expressing their cognate receptor: Five days after vector addition, >98% of GFP+ lymphocytes extracted from whole mouse blood treated with mCD8-LV were found to be CD8+. The subtype-specific presence of tagged viral glycoproteins on T cells only two hours after addition of mCD4- and mCD8-LV to whole mouse blood observed on closer examination suggest that the vectors’ selectivity is achieved at the stage of cell binding. Interestingly, receptor incompatibility is a principal barrier not only for the efficient transduction of murine cells with lentiviral, but also with adeno-associated vectors (AAVs). When the mCD8α-specific MSE10 DARPin was inserted into the GH2/GH3 loop of VP1 of the AAV2 capsid, the resulting DARPin-targeted (DART) mCD8-AAV displayed near-absolute selectivity for CD8+ primary murine lympho- cytes and transducing titers six- to sevenfold higher than those of regular AAV2. When mCD8- and mCD4-LV were used for GFP transfer in BALB/c mice, protein and genome level transfer signals were close to the lower limit of detection, but were strongest in the tissues with the highest T cell content. Notably, pronounced remodeling of the lymphoid compartment, i.e. decreases in the relative frequency and increases in size and granularity of CD3+ cells in spleen and blood, were observed, indicating an immune response to vector administration. Host response was minimal when a mix of phagocytosis-shielded CD47hi mCD8- and mCD4-LVs was systemically injected into BALB/c mice to generate αmCD19-CAR T cells directly in vivo, as no signs of immune activation were observed and no CAR-related changes in peripheral blood were found within 43 days post injection. On final analysis, qPCR identified splenic vector integration only in treated mice, and flow cytometric analysis yielded a shift of the CD3+/CD19+ composition in spleens of vector-treated animals. Data highlighting the considerable influence of receptor targeting on vector biodistribution was obtained when mCD8-AAV was tested in Ai9 mice. In this reporter-tolerant system, infusion of mCD8-AAV resulted in >87% specific trans- duction of mCD8+ cells and overall transduction rates in blood, spleen and bone marrow approximately 4-100 fold higher than for unmodified AAV2. Additionally, targeting of AAVs by MSE10 was found to reduce liver transduction, assessed by measuring whole organ surface fluorescence, twentyfold. The observed utility of receptor targeting in the context of two molecularly distinct vector platforms well-illustrates its crucial role in the maturation of gene therapy, enabling pivotal vector platforms as well as their detailed preclinical examination. Indeed, the syngeneic mouse models enabled here through the generation of mouse-compatible viral vectors well-summarized current concerns in the field, as they confirmed both the challenge in vivo gene therapy faces from restrictive host responses – stressing the urgent need for the evaluation and implementation of immune-modulatory strategies to enable productive in vivo transduction in immunocompetent systems – and the key role of receptor targeting technology in profoundly improving genetic treatment, e.g. by decreasing liver burden for a vector class whose liver toxicity upon systemic administration is an emerging issue.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Durchbrüche in genetischer Vektortechnologie schicken sich an, das noch junge Feld der Gentherapie grundlegend zu verändern, indem sie die Entwicklung breit anwendbarer, verträglicher Produkte nie vorher da gewesener Wirksamkeit ermöglichen. Eine Schlüsseltechnologie ist dabei die Rezeptortargetierung von Vektorpartikeln, deren transformatives Potenzial von kürzlich erschienenen präklinischen Berichten zur Generierung von mit chimären Antigenrezeptoren (CARs) ausgestatteten T-Zellen direkt in vivo eindrucksvoll veranschaulicht wurde. Wichtige Fragen jenseits solcher Machbarkeitsdemonstrationen sind jedoch bisher unbeantwortet geblieben, vor allem solche, die die Auswirkung einer durch Vektorgabe ausgelösten Immunantwort auf die Wirksamkeit und das Nebenwirkungs- profil der Therapie betreffen. Zur Beantwortung solcher Fragestellungen können syngene Mausmodelle, welche in der Lage sind, die Reaktionen eines kompletten Säugerimmunsystems auf Vektorinjektion wiederzugeben, Erkenntnisse aus humanisierten Mausmodellen hilfreich ergänzen und so die gründliche Untersuchung der Interaktion von Vektor und Wirt ermöglichen, die in Anbetracht der turbulenten Geschichte klinischer Forschung in der Gentherapie angemessen erscheint. Voraussetzung für solche Modelle ist das Vorhandensein mauskompatibler Ersatzreagenzien, welche im Fall rezeptortargetierter viraler Vektoren bisher nicht verfügbar waren. Diese Thesis beschreibt die Generierung und Charakterisierung solcher mausverträglicher viraler Vektoren und ihren Einsatz zur syngenen Modellierung der in vivo Gentherapie. Gegen murines CD4 bzw. CD8 gerichtete lentivirale Vektoren (mCD4- und mCD8-LVs) wurden durch Insertion des anti-mCD8α MSE10 designed ankyrin repeat protein (DARPin) bzw. des anti-mCD4 Einzelkettenantikörperfragments GK1.5 in den Masernviruspseudotyp geschaffen, für dessen Entwicklung das gastgebende Labor dieser Doktorarbeit maßgebliche Arbeit geleistet hat. Durch die Insertion mausrezeptorgerichteter Binder wurden die lentiviralen Partikel mauskompatibel, d.h. auf primären murinen Splenozyten wurden ähnliche Gentransferaktivitäten beobachtet wie für gegen menschliches CD4 und CD8 gerichtete LVs auf menschlichen T-Zelllinien. Zusätzlich waren die Vektoren auch in komplexeren Zellgemischen sehr selektiv für Zellen, die den entsprechend kognaten Rezeptor exprimierten: So waren fünf Tage nach Vektorzugabe mehr als 98% der aus vektorbehandeltem Vollblut isolierten GFP-positiven Lymphozyten CD8-positiv. Bei näherer Untersuchung der Bindungseigenschaften wurde die subtypspezifische (d.h. CD4- oder CD8-spezifische) Präsenz viraler Glykoproteine auf T-Zellen aus Vollblut bereits zwei Stunden nach Zugabe von mCD4- und mCD8-LV festgestellt, was nahelegt, dass die hohe Selektivität im Zuge der Zellbindung zustande kommt. Bemerkenswerterweise scheint Rezeptorinkompatibilität nicht nur ein Hindernis für die effiziente Transduktion von Mauslymphozyten durch LVs zu sein, sondern auch durch die lentiviralen Vektoren molekular recht unähnlichen adenoassoziierten Vektoren (AAVs). Durch Insertion des MSE10 DARPin in die GH2/GH3-Schleife von VP1 des AAV2-Kapsids wurden sogenannte "DARPin-targetierte" (DART) mCD8- AAVs generiert, die sich auf primären murinen Splenozyten durch fast vollständige Selektivität für mCD8 und unerwarteterweise durch gegenüber unmodifizierten AAV2-Partikeln sechs- bis siebenfach höhere Transduktionstiter auszeichneten. Bei der Verwendung von mCD4- und mCD8-LV zum Transfer von GFP in BALB/c Mäusen lagen Transfersignale auf Protein- und Genomebene jeweils nah an der unteren Detektionsgrenze, waren jedoch in denjenigen untersuchten Geweben am ausgeprägtesten, die den höchsten Anteil von T-Zellen aufwiesen. Gleichzeitig fand in Folge der Vektorinjektion in Blut und Milz eine Restrukturierung der lymphoiden Zellnische hin zu niedrigeren relativen Konzentrationen, höherer Granularität und grösserem Durchmesser von CD3-positiven Zellen statt, welche auf eine Immunantwort gegenüber der Vektorgabe hindeutet. In einem ebenfalls in BALB/c Mäusen durchgeführten Folgeexperiment kamen vor Phagozytose durch Überexpression des menschlichen Phagozytoseinhibitors CD47 in Produktionszellen geschützte, gegen murines CD19 gerichtete CAR transferierende mCD4- und mCD8-LVs zum Einsatz. Hier wurden keine Anzeichen einer Immunmobilisierung beobachtet, und es gab über einen Zeitraum von dreiundvierzig Tagen nach Vektorgabe keine messbaren Veränderungen im peripheren Blut der Tiere. Im Zuge der finalen Analyse fünfzig Tage nach Vektorinjektion wurde splenische Integration des Vektorgenoms nur in vektorbehandelten Mäusen festgestellt. Zusätzlich wurde in vektorbehandelten Tieren eine Verschiebung des Verhältnisses von CD3+ zu CD19+ Zellen zugunsten ersteren Typs beobachtet. Den beträchtlichen Einfluss von Rezeptortargetierung auf die Biodistribution von Vektoren aufzeigende Daten konnten in einem anderen experimentellen System gesammelt werden: In reportertoleranten Ai9 Mäusen resultierte die Infusion von Cre-transferierenden mCD8-AAV in mehr als 87% spezifischer Transduktion von CD8-positiven Zellen in Blut, Milz und Knochenmark und im Erreichen von vier- bis hundertfach höheren Transduktionsraten als durch die Gabe der gleichen Vektorgenomdosis AAV2. Zusätzlich war das durch mCD8-AAV hervorgerufene Leberoberflächenfluoreszenzsignal etwa zwanzigmal niedriger als das von AAV2 hervorgerufenene. Die scheinbar zentrale Rolle der Rezeptortargetierung in der Nutzbarmachung zweier molekular distinkter Vektorplattformen für den murinen Kontext verdeutlicht die Wichtigkeit der Technologie in der weiteren Entwickung der Gentherapie, in der sie nicht nur richtungsweisenden Vektorplattformen zugrundeliegt, sondern auch die gründliche präklinische Testung selbiger ermöglicht. Tatsächlich unterstreichen die beschriebenen Mausexperimente nicht nur die Bedeutung der im Fachdiskurs an Brisanz gewinnenden Herausforderung der Wirtsimmunität für in vivo Gentherapie und die dringende Notwendigkeit zur Evaluierung und Implementierung immunmodulatorischer Maßnahmen zur Ermöglichung produktiver in vivo Gentherapie in immunkompetenten Systemen: Die beobachtete Verringerung der hepatischen Belastung bei einer für das Risiko von Lebertoxizität nach systemischer Anwendung unter Beobachtung stehenden Vektorklasse veranschaulicht die Schlüsselrolle der Rezeptortargetierung in der Realisierung substanziell verbesserter, breiter zugänglicher Gentherapien.

German
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-240766
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 10 Department of Biology > Stem Cell and Developmental Biology
Date Deposited: 19 Jun 2023 12:02
Last Modified: 20 Jun 2023 05:50
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/24076
PPN: 508909260
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