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Structure/Function Analysis of the Viral Potassium Channel Kcv - Mutagenesis studies of the two transmembrane domains

Gebhardt, Manuela :
Structure/Function Analysis of the Viral Potassium Channel Kcv - Mutagenesis studies of the two transmembrane domains.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Structure/Function Analysis of the Viral Potassium Channel Kcv - Mutagenesis studies of the two transmembrane domains
Language: English
Abstract:

The viral potassium channel Kcv from Paramecium bursaria chlorella virus 1 (PBCV-1) is with only 94 amino acids minimal in size. Indeed, Kcv is one of the smallest potassium channels known so far, but still exhibits almost structural and functional hallmarks of complex potassium ion channels. Here we analyse the importance of the two transmembrane domains (TMD) for channel function. Using an alanine-scanning approach in combination with yeast complementation and electrophysiological recordings, we identified crucial important sites in both TMDs, which are important for channel function. Many of the key amino acids are located in the outer transmembrane domain and are essential for the correct positioning of the protein in the lipid membrane. Snorkeling effects in KcvPBCV-1 are nonessential for a proper channel function: A lysine near the water/lipid interface in a TM segment is able to snorkel. This snorkeling can increase the hydrophobic length of TM segments and helps to span the lipid membrane. Computational studies of KcvPBCV-1 have shown that the lysine at position 29 in the TMD1 has to be deprotonated for proper channel function. Extensive mutational studies of the lysine at position 29 in KcvPBCV-1 have shown that all amino acid exchanges, with exception of proline, are allowed at this position. This means that KcvPBCV-1 indeed tolerates a neutral amino acid in this position without loosing function. However, when the equivalent lysine, which is highly conserved in viral channels, is substituted by alanine in the related channels KcvMT325 or KcvATCV-1, these channels loose their function. The latter two channels do not have the cytosolic N-terminal domain, which is essential in KcvPBCV-1. We therefore propose that the snorkeling effect is becoming essential in the structural context of the Kcv channels without cytosolic N-terminus, and that this feature is not crucial for the functionality of KcvPBCV-1. Aromatic amino acids in the TMD1 are crucial for the anchoring of the protein in the lipid membrane: TMD1 contains several aromatic amino acids. According to the structural model of Kcv, these aromatic side chains are facing towards the lipid membrane and anchor the channel in the membrane. The anchoring is also reflected in the distribution of the b-factors of Kcv, which are a measure for the flexibility or rigidity of the amino acids. The N-terminus of Kcv and the first half of the TMD1 exhibit high b-factors and are flexible; the rest of the TMD1, starting from His17, is rigid with low b-factors. The alanine exchange experiments underscore the functional importance of this anchoring. An exchange of the aromatic residues in TMD1 beginning with His17 greatly reduces or abolishes channel function. These negative effects on channel function can be explained by a decreased anchoring of the protein in the membrane. The π-stack between the two TMDs stabilises the spatial structure of the channel: Alanine-scanning mutagenesis together with information on the three dimensional structure of Kcv identified intramolecular interactions between the TMD1 (Phe30) and the TMD2 (His83). A π-π-interaction between aromatic rings in TMD1 and TMD2 generates a tight connection (π-stack) between the two TMDs and coordinates them into the correct position. A mutation of one of the π-stack-partners leads nearly in all cases to the loss of the channel function. Only substitutions in one partner amino acid (Phe30), which also allow π-stacking interactions (Try, Met), are still able to maintain channel function. The results of these experiments imply that the intramolecular contact between the TMDs is essential for function. The position of the π-stack in the channel model suggests, that the rigid part of TMD1 allows the stabilising of the upper part of TMD2 via this connection. The C-terminal amino acid influences the potassium concentration in the cavity: Mutations of the last C-terminal amino acid of the TMD2 in KcvPBCV-1 affect the activity of the channel. Computational data of the potassium concentration profiles of the different mutants predict that these mutations influence the internal potassium concentration of the channel. These changes do not occur, as expected, directly at the mouth of the channel but in the cavity. A theoretically predicted depletion or accumulation of potassium in the cavity, as a result of a mutation of the terminal amino acid, generates channels, which show in the experiments either a lower or no activity. Therefore, small changes in the amino acid sequence could cause drastic effects in the global K+ concentration distribution in the channel and, therewith, influences channel function. The good agreement between theory and experiment suggests that an optimal K+ concentration is essential for a proper channel function; a too high or too low K+ concentration leads to reduced or no channel function. Furthermore, the results reveal the quality of the homology model of Kcv, which enables us to find long-term interactions between the C-terminus and the cavity, an interaction, which is independent on the salt bridges at the cytosolic entrance of the channel.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Der virale Ionenkanal Kcv aus dem Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 (PBCV-1) ist mit nur 94 Aminosäuren sehr klein. In der Tat handelt es sich bei Kcv um einen der kleinsten bekannten Kaliumkanäle, der aber nichtsdestotrotz alle stukturellen und funktionellen Merkmale komplexer Kaliumkanäle besitzt. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der beiden Transmembrandomänen (TMD) auf die Kanalfunktion untersucht. Durch die Kombination eines Alanin-Scans mit Hefekomplementationstests und elektrophysiologischen Messmethoden war es möglich, Positionen in beiden TMDs zu identifiziren, die für die Kanalfunktion essentiell sind. Viele dieser Schlüsselaminosäuren befinden sich dabei in der äußeren TMD und sind von grundlegender Bedeutung für die richtige Positionierung des Proteins in der Membran. “Snorkeling” Effekte sind für die Funktionalität von KcvPBCV-1 nicht essentiell: Ein Lysin in der Nähe der Wasser/Lipid Grenzschicht ist in der Lage zu „snorkeln“. Dieser „snorkeling“ Effekt kann die hydrophobe Länge eines TM Segments erhöhen und damit die Inserierung in die Membran erleichtern. Computergestütze Analysen von KcvPBCV-1 haben gezeigt, dass das Lysin an Position 29 in der ersten TMD von KcvPBCV-1 im deprotonierten Zustand vorliegen muss, um eine funktionelle Kanalsimulation zu erzeugen. Ausführlich Mutationsstudien dieser Position in KcvPBCV-1 zeigten aber, dass alle Aminosäureaustausche, mit der Ausnahme von Prolin, zu einem funktionellen Kanal führen. Das bedeutet, das KcvPBCV-1 auch ungeladene Aminosäuren an dieser Position toleriert, ohne dass dadurch die Kanalfunktion beeinträchtigt wird. Vergleichbare Positionen des Lysins sind innerhalb der viralen Kaliumkanäle hochkonserviert.Wird nun aber das Lysin in den verwandten Kanälen KcvMT325 oder KcvATCV-1 gegen Alanin ausgetauscht, führt dies zum Verlust der Funktionalität dieser Kanäle. Die beiden Kanäle KcvMT325 und KcvATCV-1 besitzen nicht die für KcvPBCV-1 essentielle cytosolische N-terminale Domäne. Daher ist es möglich, dass „snorkeling“ Effekte zwar für die Funktionalität von Kcv Kanäle ohne cytosolischen N-Terminus von entscheidener Bedeutung sind, nicht aber für KcvPBCV-1. Aromatische Aminosäuren der TMD1 sind wichtig für die Verankerung des Proteins in der Lipidmembran: Die erste TMD von Kcv ist reich an aromatische Aminosäuren. Das Strukturmodell von Kcv verdeutlicht, dass die Seitenketten dieser aromatischen Aminosäuren zur Membran hin orientiert sind und dadurch den Kanal in der Membran verankern. Diese Verankerung spiegelt sich auch in der Verteilung der b-Faktoren wieder, welche ein Maß für die Flexibilität bzw. Starrheit einer Aminosäure sind. Der N-Terminus von Kcv und die erste Hälfte der TMD1 besitzen hohe b-Faktoren und sind demnach flexibel, der Rest der TMD1, beginnend mit His17, ist starr und besitzt niedrige b-Faktoren. Alanin-Substitutionsexperimente bestätigen dabei, dass die Verankerung entscheidend ist für die Funktionalität. Ein Austausch der aromatischen Aminosäuren der TMD1 führt, ab dem His17, zu einer stark verringerten Kanalfunktion bzw. zu einem völligen Verlust der Funktionalität. Dieser negative Effekt auf die Funktionalität kann durch die verminderte Verankerung des Proteins in der Membran erklärt werden. Der π-stack zwischen den beiden TMD stabilisiert die räumliche Struktur des Kanals: Mit der Hilfe des Alanin-Scans und des dreidimensionalen Modells von Kcv war es möglich, intramolekulare Interaktionen zwischen der ersten (Phe30) und zweiten TMD (His83) zu identifizieren. Diese π-π-Wechselwirkungen (π-stack) zwischen den aromatischen Ringen der TMD1 und TMD2 führen zu einer festen Verbindung zwischen den beiden Domänen und halten sie somit in der richigen Position. Durch die Mutation eines der beiden Wechselwirkungspartner kommt es in nahezu allen Fällen zu einem Verlust der Kanalfunktion. Die einzige Ausnahme dabei bildet die Substitution des Phe30 zu Aminosäuren, die ebenfalls in der Lage sind einen π-stack auszubilden (Tyr, Met) und somit die Kanalfunktion erhalten können. Die Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung der intramolekularen Interaktionen zwischen den beiden TMD für die Kanalfunktion. Die Positionierung des π-stacks im Kanalmodell läßt vermuten, dass mittels dieser Wechselwirkungen der starre Teil der TMD1 eine Stabilisierung des oberen Abschnittes der TMD2 bedingt. Die C-terminale Aminosäure beeinflußt die Kaliumkonzentration in der Cavität: Mutationen der letzten Aminosäure des C-Terminus der TMD2 von KcvPBCV-1 beeinflussen die Kanalaktivität. Berechnungen von Kalium-Konzentrationsprofilen verschiedener Kanalmutanten ergaben, dass diese Mutationen die interne Kaliumkonzentration des Kanals beeinflussen. Diese Konzentrationsveränderungen treten dabei nicht, wie erwartet, direkt am Eingang des Kanals auf, sondern in der Cavität. Dabei stimmen die theoretisch getroffenen Vorhersagen über eine An- oder Abreicherung von Kalium in der Cavität, durch die Mutation der C-terminalen Aminosäure, mit der experimentell beobachteten reduzierten Kanalaktivität bzw. dem völligen Verlust der Funktionalität überein. Somit verursachen kleine Veränderungen der Aminosäuresequenz weitreichende Veränderungen in der globalen Konzentrationsverteilung der Kaliumionen im Kanal und beeinflussen damit dessen Funktion. Die gute Übereinstimmung zwischen Theorie und Experiment legt die Vermutung nahe, dass eine optimale Kaliumkonzentration die Vorraussetzung für die richtige Funktion des Kanals ist. Zu hohe oder zu niedrige Konzentrationen dagegen können die Funktionalität herabsetzen oder gar ganz verhindern. Des Weiteren spiegeln die Ergebnisse die Qualität des Homologiemodells von Kcv wider welches es ermöglicht, weitreichende Interaktionen zwischen dem C-Terminus und der Cavität aufzudecken, die scheinbar unabhängig von dem Vorhandensein der Salzbrücken an der cytosolischen Eingangsseite des Kanals sind.German
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 580 Pflanzen (Botanik)
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 18 Jan 2011 09:33
Last Modified: 07 Dec 2012 11:59
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-23913
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed: 10 December 2010
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2391
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