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The human cytidine deaminase APOBEC3C restricts retroviruses independent of editing – A biochemical and structural analysis

Hofmann, Henning :
The human cytidine deaminase APOBEC3C restricts retroviruses independent of editing – A biochemical and structural analysis.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2011)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: The human cytidine deaminase APOBEC3C restricts retroviruses independent of editing – A biochemical and structural analysis
Language: English
Abstract:

The capability of the Human immunodeficiency virus (HIV) to replicate in cells of different species depends on the presence or absence of interacting or restricting cellular factors. The restriction factors are part of the host’s defense mechanism against pathogens. The family of human APOBEC3 (A3) cytidine deaminases forms part of the intrinsic immunity and protects placental mammals from viral pathogens. A3 proteins have one or two copies of a cytidine deaminase motif and can restrict retroviral replication by deamination of their genomes during reverse transcription. HIV counteracts this inhibition by the Vif-protein, which induces the destruction of A3s and thereby prevents its incorporation into virions. Although one member of this human protein family, APOBEC3C (A3C), is highly expressed in many human tissues and in CD4+ T cells, A3C does not restrict vif-deficient HIV (HIV Δvif) but is active against SIV Δvif. This study aimed to characterize i) the different mechanisms of resistance of HIV and SIV against A3C, ii) the restriction mechanism of A3C against SIV, and iii) residues crucial for the antiviral activity of A3C based on a structural model. With the help of a three- dimensional protein model of A3C, amino acids residues were predicted and finally experimentally identified that are involved in protein dimerization and that mediate the incorporation of A3C into virions. The result showed that dimerization of A3C is essential for antiviral activity against SIV. Beside dimerization, the antiviral activity is regulated by encapsidation into viral particles. Encapsidation of A3C depends on the substrate binding-pocket distal from the zinc-coordinating enzymatic centre. This binding pocket mediates the RNA-dependent incorporation of the protein into budding viral particles. It was found that A3C restricts SIV Δvif without cytidine deamination of viral ssDNA. Therefore, alternative mechanisms were investigated. In this study the experiments showed clearly that A3C does neither deaminates viral RNA nor has a significant inhibitory effect on the reverse transcription of SIV. Thus, it is likely that A3C has a so far unknown restriction mechanism against SIV Δvif. Results of this study also show that the resistance of HIV against A3C can be overcome. An A3C mediated inhibition of HIV was achieved by fusing the Viral Protein R (Vpr) of HIV-1 either to the C- or N- terminus of A3C. Interestingly both, A3C and Vpr.3C were incorporated into viral particles and found to be localized in the same viral compartment, the viral core. These data indicate that HIV encodes a factor additional to vif to counteract the A3C activity. In search for such a viral factor, the viral integrase was identified as a candidate inhibitor of A3C. Additional experiments are required for a better understanding of the interaction of A3C with HIV. However, the results here implicate that enhancing the antiviral activity of the ubiquitously expressed A3C would likely repress HIV-1 replication in patients and thus should be considered as a novel approach for treatment.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die Fähigkeit des Humanen Immundefizienz Virus (HIV) in Zellen verschiedener Spezies zu replizieren ist häufig abhängig von der An- oder Abwesenheit interagierender oder einschränkender zellulärer Faktoren. Restriktionsfaktoren stellen einen Teil des Abwehrmechanismus des Wirts gegen Pathogene dar. Die Familie der humanen APOBEC3 (A3) Zytidin-Deaminasen ist Teil der intrinsischen Immunität und schützt höhere Säugetiere vor viralen Pathogenen. A3 Proteine tragen eine oder zwei Kopien eines Zytidin-Deaminase Motivs und können die retrovirale Replikation inhibieren, indem sie deren Genom während der reversen Transkription deaminieren. Diese Inhibition wird von HIV durch das Vif-Protein überwunden, welches den Abbau von A3s induziert und damit deren Verpackung in Virionen verhindert. Obwohl ein Mitglied dieser humanen Proteinfamilie, APOBEC3C (A3C), hoch in vielen menschlichem Geweben und in CD4+ T-Zellen exprimiert wird, kann A3C nur vif-defizientes SIV (SIVΔvif), nicht aber HIVΔvif inhibieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, 1.) die unterschiedlichen Resistenzmechanismen von HIV und SIV gegenüber A3C zu definieren, 2.) den Restriktionsmechanismus von A3C gegenüber SIV zu charakterisieren, und 3.) basierend auf einem Strukturmodel Aminosäurereste zu identifizieren, die relevant für die antivirale Aktivität von A3C sind. Mit der Hilfe eines dreidimensionalen Proteinmodels wurden Aminosäurereste prognostiziert und experimentell identifiziert, die in die Dimerisierung des Proteins oder dessen Verpackung in virale Partikel involviert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass die Dimerisierung von A3C notwendig für dessen antivirale Aktivität gegen SIV ist. Neben der Dimerisierung wird die antivirale Aktivität durch Verpackung in virale Partikel reguliert. Die Verpackung von A3C beruht auf einer Substratbindetasche, die distal des Zink-koordinierenden enzymatisch aktiven Zentrums liegt. Diese Bindetasche vermittelt die RNA-abhängige Verpackung des Proteins in das knospende Virus. Es konnte gezeigt werden, dass der Mechanismus der A3C-vermittelten Restriktion von SIVΔvif nicht die Deaminierung virale ssDNA ist. Die experimentelle Untersuchung alternativer Mechanismen zeigte, dass A3C weder virale RNA deaminiert, noch einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf die reverse Transkription von SIV hat. Daher ist anzunehmen, dass A3C einen zusätzlichen, nicht bekannten Restriktionsmechanismus gegen SIV besitzt. Ergebnisse dieser Arbeit zeigen weiterhin, dass die Resistenz von HIV gegen A3C überwunden werden kann. Eine A3C vermittelte Restriktion von HIV wurde durch eine N- oder C-terminale Fusion des viralen Proteins R (Vpr) von HIV-1 an A3C erreicht. Interessanter Weise wurden beide Proteine, A3C und Vpr.3C, ins Virus verpackt und waren im gleichen viralen Kompartiment, dem viralen Core, zu finden. Diese Daten weisen darauf hin, dass ein von HIV zusätzlich zu vif kodierter Faktor der A3C Aktivität entgegenwirkt. Auf der Suche nach einem derartigen Faktor, konnte die virale Integrase als ein Kandidat identifiziert werden. Weitere Experimente sind notwendig, um die Interaktion von A3C mit HIV besser zu verstehen. Jedoch implizieren die Ergebnisse dieser Arbeiten, dass eine Steigerung der antiviralen Aktivität des ubiquitär exprimierten A3C die Replikation von HIV in Patienten eindämmen könnte und so einen neuen Behandlungsansatz ermöglicht.German
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 20 Jan 2011 12:24
Last Modified: 07 Dec 2012 11:59
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-23795
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Muenk, Prof. Dr. Carsten and Kletzin, PD Dr. Arnulf
Refereed: 3 December 2010
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2379
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