Auf dem Gebiet der Biologika haben monoklonale Antikörper (mAb) in den letzten Jahrzehnten den Markt mit Blockbustern und umsatzstarken Medikamenten durchdrungen. Fortschritte bei der Entwicklung neuer Technologien gingen einher mit rasanten Fortschritten bei der Entdeckung neuartiger Antikörper und Wirkmechanismen, die es ermöglichen, neue Anwendungsgebiete zu erschließen. Insbesondere Display-Technologien, In-vitro-Systeme und Hoch- bzw. Ultra-Hochdurchsatz-Technologien ermöglichen heute die Isolierung von biologischen Wirkstoffkandidaten in relativ kurzen Zeiträumen.

In der ersten hier vorgestellten Studie lag der Schwerpunkt auf der Herstellung eines bidirektionalen Plasmids für die rekombinante Antikörperproduktion in Säugetierzellen, um die native Antikörperfaltung und posttranslationale Modifikationen zu erleichtern. Konventionelle Ansätze für die transiente Antikörperproduktion nutzen die Co-Transfektion von Genen der schweren und der leichten Kette eines Antikörpers, die auf separaten Plasmiden kodiert sind. In der vorgestellten Studie wird nur ein einziges Plasmid unter der Kontrolle von zwei unabhängigen Promotoren eingesetzt. Der Fokus lag dabei auf der Untersuchung, welche Promotorkombination die beste Antikörperausbeute für zwei von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Antikörper, Durvalumab und Avelumab, erbringt. Durch die Kombination von Promotoren unterschiedlicher Stärke (CMV, minCMV, EF-1α und Enhanced CMV) für die Genexpression der schweren und leichten Kette, waren die IgG-Ausbeuten am höchsten bei der 2xeCMV-Kombination. Bei dieser wurden zwei gespiegelte eCMV-Kassetten eingesetzt, welche die Expression der leichten und schweren Kette individual in jeder Richtung steuerten. Diese Kombination bewirkte eine hohe mRNA-Syntheserate für beide Ketten in zwei standardmäßig eingesetzten Säugetierzelllinien und die höchsten Ausbeuten an Antikörpern, vergleichbar mit der herkömmlichen Co-Transfektionsmethode. Der Ersatz der Co-Transfektionsmethode bei Einsatz zweier Plasmide durch dieses bidirektionale Plasmid verringert den Aufwand für die Plasmidpräparation, was die gleichzeitige Bearbeitung einer größeren Anzahl von Antikörperkandidaten ermöglicht.

In der zweiten Studie wurde das zuvor beschriebene bidirektionale Plasmid verwendet, um eine Fab-Bibliothek aus immunisierten OmniRats zu generieren und die Fab-Varianten im Hefeoberflächendisplay (YSD) zu präsentieren. Nach der Durchmusterung von Antikörperkandidaten mittels fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) ist die Reformatierung einzelner Kandidaten in ihr endgültiges IgG-Format erforderlich, was mit größerem manuellem Aufwand verbunden ist und oft zu einer zeitlichen Verzögerung bei der weiteren Charakterisierung führt. Im Rahmen dieser Studie wurde ein neuartiger, auf Golden Gate Cloning (GGC)-basierender Arbeitsablauf etabliert, der die Massenreformatierung von Antikörperkandidaten nach dem YSD-FACS-Screening ermöglicht. Unter Verwendung einer von OmniRat stammenden Fab-Bibliothek gegen MerTK wurden zwei YSD-Durchmusterungsrunden mittels FACS durchgeführt. Anschließend wurden die Antikörper-kodierenden Gene in einen Mammalian_Destination (MD)-Vektor übertragen, der eine partielle Hinge-CH2-CH3 Sequenz enthielt, was nach einem GGC-Schritt mit Esp3I in einem ORF resultierte, welche die vollständige schweren Kette kodierte. Um die Volllängenvarianten zu erzeugen, wurde der hefespezifische Gal1,10-Promotor in einen abschließenden GGC-Schritt mit BbsI gegen die beschriebenen Promotorkassettenkombination aus der ersten Studie, 2xeCMV, ausgetauscht. Nach der Assemblierung enthielt der resultierende MD-Vektor die variablen Domänen aus der zweiten Sortierrunde mit den jeweiligen konstanten Domänen, die für die Produktion von IgG-Molekülen erforderlich sind. Next Generation Sequencing (NGS) aller Durchmusterungsrunden bestätigte, dass die gesamte Vielfalt der Sequenzen der VH-Familien in den resultierenden Klonen nach der Massenumformatierung wiedergefunden wurde. Zehn Kandidaten wurden anschließend transient in Säugetierzellen exprimiert und hinsichtlich ihrer Antigenbindung und biophysikalischen Eigenschaften charakterisiert. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht einen direkten Transfer von Fab Fragmente kodierenden Genen aus einem Hefedisplayvektor in einen Säugetier-Expressionsvektor, vermeidet unerwünschte Polymerase-induzierte Mutationen und erlaubt eine Massenklonierung von angereicherten Antikörperfragmenten. Durch dieses Verfahren bleibt die Paarung von schwerer und leichter Kette im Gegensatz zu anderen Reformatierungsansätzen erhalten und ebnet somit den Weg zur Beschleunigung von Antikörper Durchmusterungskampagnen mit YSD. Darüber hinaus ist diese Plattform für andere Antikörperformate und Immunisierungswirte, wie scFvs und Hühner, anpassbar und hat das Potenzial, für bispezifische oder multispezifische Antikörper entwickelt zu werden.

Antikörper der neuesten Generation, einschließlich bi- und multispezifischer Antikörper, sind in den Fokus der Forschung gerückt, da sie mehrere Wirkmechanismen gleichzeitig kombinieren und eine höhere Wirksamkeit als monoklonale Antikörper erzielen können. Eine besondere Klasse von Antikörpern sind Immunzell-Engager, welche gleichzeitig Immunzellen und tumorassoziierte Antigene (TAAs) auf malignen Zellen targetieren, und so eine Immunsynapse schaffen. Je nach adressierter Immunzelle werden spezielle Effektorfunktionen aktiviert, was in der effizienten Tötung der targetierten Zellen resultiert. Makrophagen-Engager vermitteln eine gezielte Phagozytose der angegriffenen Zelle und adressierten bisher in dem meisten Fällen die CD47/SIRPα-Achse, welche für sogenannte "Friss mich nicht"-Signale verantwortlich ist. Allerdings wird CD47 ubiquitär exprimiert und ist daher nicht selektiv. T-Cell Engager (TCEs) hingegen erkennen zumeist CD3 auf T-Zellen und zusätzlich ein TAA auf einer Tumorzelle. Durch die Bildung einer immunologischen Synapse vermittelt der TCE die Aktivierung der T Zelle, was in einer zytotoxischen Reaktion gegen die Zielzelle resultiert. Die Hyperaktivierung von T-Zellen führt zu einer Rückkopplungsschleife durch die Aktivierung von Makrophagen und damit in der Folge zur übermäßigen Freisetzung von Zytokinen, was zu Zytokinstürmen oder einem Zytokinfreisetzungssyndrom führen kann, welche unbehandelt lebensbedrohlichen Zustände hervorrufen. Daher benötigen Makrophagen-Engager und TCEs neue, zellspezifische Targets und eine Erweiterung ihres therapeutischen Fensters, um das Auftreten von Nebenwirkungen im Patienten zu verhindern. In der dritten Studie, die im Rahmen dieser kumulativen Dissertation vorgestellt wird, wurde der erste bispezifische Makrophagen-Engager generiert, welcher den Rezeptor-Tyrosinkinase MerTK und den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) targetierte. Von den zehn Antikörperkandidaten, die in der zweiten Studie entwickelt wurden, zeigte ein Kandidat ein agonistisches Wirkprofil, welches durch die dosisabhängige Aktivierung eines nachgeschalteten Signalmoleküls, phospho-AKT, nachgewiesen wurde. Die Überexpression von MerTK auf Makrophagen und tumorassoziierten Makrophagen in der Tumormikroumgebung bildet die Grundlage für die Entwicklung von Makrophagen-aktivierenden bispezifischen Antikörpern zur gezielten Phagozytose von Tumorzellen. Daher wurden biparatopische EGFR-bindende tandem-VHH-Moleküle (bezeichnet als 7D9G) in verschiedenen Architekturen mit dem MerTK mAb kombiniert, um bispezifische Moleküle zu erzeugen. Mit Hilfe der „Knob-into-Hole“-Technologie wurde ein bispezifischer Antikörper designt, welcher mit einem Fab-Arm MerTK adressiert und ein weiterer Arm durch die EGFR-bindenden tandem-VHH dargestellt wurde. Dieses Konstrukt zeigte jedoch keine agonistische MerTK Bindung. Durch die Fusion der tandem VHHs an den C-terminus der CH3-Domäne des anti-MerTK IgGs, wurde die agonistische Bindungseigenschaft wiederhergestellt. Die bispezifischen Antikörper waren in der Lage, beide Zielmoleküle gleichzeitig in ihrer löslichen Form zu binden und Makrophagen mit EGFR-positiven Tumorzellen in Kontakt zu bringen. Darüber hinaus waren sie in der Lage, mit der Bindung von EGF, dem natürlichen Liganden von EGFR, zu kompetieren und somit die EGF-vermittelte Signaltransduktion durch Hemmung von phospho-AKT zu inhibieren. Des Weiteren führten die bispezifischen Antikörper zu einer gezielten Phagozytose von EGFR-positiven Tumorzellen durch makrophagenartige THP-1-Zellen. In dieser Arbeit wurde der erste bispezifische Makrophagen-Aktivator generiert, welcher MerTK adressiert und für immunonkologische Anwendungen geeignet ist, indem er dessen Expression und Rolle in der Mikroumgebung des Tumors für die selektive Phagozytose von Tumorzellen nutzt.

In der letzten hier vorgestellten Studie wurde ein trispezifischer T-Cell Engager und Zytokinfreisetzungs-modulierender Antikörper (TriTECM) entwickelt. Hierzu wurde ein tetravalenter bispezifischer Zwei-in-Eins-Antikörper, der EGFR und PD-L1 gleichzeitig mit einem einzigen Fab-Arm bindet, mit Anti-CD3- und Anti-IL-6R-Einzelketten-Variablen-Fragmenten (scFvs) kombiniert, welche von Foralumab bzw. Sarilumab abgeleitet wurden. Es wurden zwei TriTECM-Architekturen erzeugt, die sich hauptsächlich in der Positionierung der Anti-CD3-scFvs und der Valenz der IL-6R-Bindung unterschieden, welche mehreren Wirkmechanismen vereinten. Zunächst wurde eine erhöhte Tumorspezifität gewährleistet, indem EGFR und PD-L1 mit einer niedrigen nanomolaren Affinität auf doppelt-positive Zielzellen gebunden werden. Durch Bindung an PD-L1 wurde die PD-1/PD-L1-Achse blockiert und dieser Immuncheckpoint inhibiert. Die T-Zell-Bindung und die anschließende T-Zell-vermittelte Zytotoxizität wurden abgeschwächt, was zu einer verringerten Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen führte. Abschließend kann die Hemmung des IL-6/IL-6R-Signalwegs die Zytokinausschüttung nach der T-Zell-Aktivierung herunterreguliert. Die Abschwächung der CD3-Bindung könnte es ermöglichen, Literatur-bekannte CD3-Binder zu verwenden, die zuvor nachweislich Zytotoxizität bewirkten. Angesichts der Tatsache, dass die Freisetzung von Zytokinen immer noch eine Problematik bei der Entwicklung neuartiger Immunzellen-targetierender Antikörper darstellt, sind TriTECM eine neue Klasse von Therapeutika, die das Potenzial haben, überaktivierte Immunantworten gezielt zu modulieren und den therapeutischen Index von T-Zell-aktivierenden Therapeutika zu erweitern.