Immuntherapien haben sich als erfolgreiche Behandlungsmethode im Kampf gegen Krebs herausgestellt, indem die natürliche Fähigkeit des Immunsystems genutzt wird Tumorzellen zu bekämpfen. Zusätzliche Modifikationen an den Effektorzellen haben ein neues Feld eröffnet. Zum Beispiel die Ausstattung der T-Zellen mit einem chimären Antigen-Rezeptor (CAR), um spezifisch und effizient Tumorzellen zu eliminieren. Vor allem CD19-CAR-T-Zellen haben erstaunliche klinische Erfolge in B-Zell Krebserkrankungen gezeigt und spiegelt sich in der Marktzulassung von aktuell vier CD19-CAR-T-Zellprodukten wider. Trotz der großen Erfolge von CAR-T-Zellen ist die Anwendung dieser Therapie durch die lange ex vivo Produktionszeit limitiert, die mehrere Wochen andauern kann. Derzeitige Bemühungen die Produktionszeit zu verkürzen oder zu vermeiden, beinhalten die ex vivo Herstellung von CAR-T-Zellen innerhalb weniger Tage oder die Erzeugung von CAR-T-Zellen in vivo im Körper. Die vorliegende Arbeit untersucht diese neuen Herstellungsansätze näher in Modelsystemen mit besonderem Fokus auf myeloiden Zellen, um ein besseres Verständnis über potenzielle Sicherheitsrisiken und Hürden in der klinischen Umsetzung zu bekommen. Die Umsetzbarkeit von in vivo CAR-T-Zellgenerierung konnte bereits mit CD8 und CD4 Rezeptor-targetierten lentiviralen Vektoren (CD8-LV und CD4-LV) in präklinischen humanisierten Mausmodellen in früheren Studien der Arbeitsgruppe gezeigt werden. Allerdings haben sich diese Studien nur auf humanisierte Mausmodelle beschränkt, die nur bedingt den physiologischen Anteil von myeloiden Zellen im Menschen darstellen. Deswegen wurde in dieser Arbeit das CD34+ Stammzell-humanisierte NSG-SGM3 (huSGM3) Mausmodell verwendet, das einen bedeutenden Anteil an humanen angeborenen Immunzellen, vor allem Monozyten und Makrophagen, im System entwickelt, um in vivo CAR-T-Zellgenerierung zu untersuchen. Intravenöse (i.v.) Injektion von CD4-LV, CD8-LV oder eine Mischung von beiden Vektorarten führte zur erfolgreichen Generierung von CD19-CAR-T-Zellen im Blut von einigen Mäusen. Bedeutenswert war hierbei die spezifische CAR Expression in den jeweilig targetierten CD4 oder CD8 T-Zellsubtyp, ohne bemerkbare unspezifische Transduktion anderer Zelltypen. Die Reduktion von CD19+ Zielzellen im Körper unterstrich die Präsenz von funktionalen CD19-CAR-T-Zellen im peripheren System aber auch in verschiedenen lymphozytenreichen und biodistributionsrelevanten Organen. Weiterhin zeigte die Expansion von CAR-T-Zellen in der Zellkultur in der Gegenwart von Tumorantigen die Präsenz und lange Persistenz von in vivo generierten CART-Zellen in der Milz von einigen Mäusen. Außerdem konnte eine erfolgreiche Transgenintegration mittels qPCR-Analyse bestätigt werden. Im Allgemeinen war die Effizienz für in vivo CAR-T-Zellgenerierung in huSGM3 Mäusen jedoch geringer verglichen zu vorhanden Daten in CD34+ Stammzell-humanisierten NSG Mäusen. Überraschend war insbesondere die geringe in vivo CAR-T-Zellgenerierungseffizienz in CD4-LV injizierten Mäusen. Dies korrelierte zudem mit einem typischen Zytokinmuster für aktivierte humane myeloide Zellen im Plasma dieser Tiere. Eine reduzierte in vitro Transduktion von T-Zellen mit CD4-LV und CD8-LV in der Präsenz von Monozyten oder Makrophagen identifizierte diese Zellen als potenzielles Hindernis für in vivo CAR-T-Zellgenerierung. Bemerkenswert war, dass die Abschirmung der CD4-LV und CD8-LV vor Phagozytose, durch die Nutzung von ß2M-/-, CD47high HEK-293T Verpackungszellen für die Vektorpartikelproduktion, die CAR-T-Zellgenerierung in der Ko-kultur wesentlich verbesserte. Des Weiteren konnten diese Modifikationen die in vivo CAR-T-Zellgenerierung in huSGM3 Mäusen im Vergleich zu den konventionellen CD4-LV und CD8-LV verbessern. Das zeigte sich in höheren Vektorintegrationszahlen und ausgeprägteren CD19+ Zellreduktionen in der Milz und Knochenmark für beide abgeschirmte Vektorarten und zusätzlich auch in höheren CAR-T-Zellzahlen im Blut für abgeschirmte CD4-LV. Die Reduzierung der ex vivo Produktionszeit von CAR-T-Zellen ist ein anderer Weg, um das Herstellungsverfahren zu verbessern. In dieser Arbeit wurden CD19-CAR-T-Zellen, die innerhalb von 3 Tagen mittels lentiviraler Vektorinkubation hergestellt wurden (Kurzzeit-CAR-T-Zellen), auf ihre Zellkomposition untersucht und deren Potential das Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) auszulösen, welches eine häufig auftretende Nebenwirkung in der CAR-T-Zelltherapie ist. Die Charakterisierung der Kurzzeit-CAR-T-Zellen nach der Produktion zeigte, dass die meisten Zellen Vektorpartikel gebunden haben, jedoch nur ein geringer Anteil der Zellen positiv für das CAR war. In einem eigens konzipierten Ko-kultur-Model mit Tumorzellen und Monozyten konnte die anti-tumorale Aktivität von den Kurzzeit-CAR-T-Zellen nachgewiesen werden, die bereits nach 24h der Ko-kultur erhebliche CAR Expression zeigten. Des Weiteren wurde eine hohe Ausschüttung von CRS-relevanten Zytokinen mitunter IL-6, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-2 und IL-10 während der Ko-Kultivierung gemessen. Abschließende Evaluierung der Kurzzeit-CAR-T-Zellen in NSG-SGM3 Mäusen mit hoher Tumorlast zeigte nach i.v. Verabreichung einer hohen Zelldosis schwerwiegende akute Nebenwirkungen innerhalb der ersten 24 Stunden. Dazu zählten körperliche Krankheitszeichen, Temperatur- und Gewichtsverlust, sowie systemisch erhöhte Zytokine für humanes IFN- γ, TNF-α, IL-2 and IL-10 durch die Kurzzeit-CAR-T-Zellen und murines MCP-1, IL-6 and G-CSF durch das Maussystem. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit das Potential von komplexen Modelsystemen mögliche Hürden und Sicherheitsrisiken von neuartigen Herstellungsansätzen von CAR-T-Zelltherapie zu erforschen. Sie ermöglichten die Identifizierung von humanen Monozyten und Makrophagen als potentielle Barriere für in vivo CAR-T-Zellgenerierung und legen die Implementierung von Phagozytoseabschirmung in targetierten LVs nah, um die angeborene Immunantworten in einem solchen Ansatz zu reduzieren. Des Weiteren zeigten diese Modelsysteme das mögliche Risiko auf, dass Kurzzeit-CAR-T-Zellen schwerwiegendes akutes CRS auslösen können und halten zu einem vorsichtigen Angehen in der Klinik an und weiteren Untersuchungen mit diesen Modellplattformen.