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Heterochromatin composition, organization and MeCP2 post-translational modifications

Schmidt, Annika (2023)
Heterochromatin composition, organization and MeCP2 post-translational modifications.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00022961
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Heterochromatin composition, organization and MeCP2 post-translational modifications
Language: English
Referees: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina ; Nuber, Prof. Dr. Ulrike A.
Date: 2023
Place of Publication: Darmstadt
Collation: VI, 165 Seiten
Date of oral examination: 23 November 2022
DOI: 10.26083/tuprints-00022961
Abstract:

In the cell nucleus, the DNA together with several other factors is packaged into chromatin which is organized into active and inactive compartments called euchromatin and heterochromatin. The maintenance of the silenced and compacted heterochromatin state is highly important for the genome stability and spatial organization of nuclear compartments and its misfunction can cause severe deficits in cellular processes. Heterochromatin is comprised of facultative heterochromatin that becomes active in specific situations and constitutive heterochromatin that is mostly silenced and constantly compacted. Constitutive heterochromatin from (peri)centromeric regions of several chromosomes fuses during interphase in mouse cells making up heterochromatin clusters. As the mechanism of the formation of constitutive heterochromatin and the factors involved in the process are not fully understood, we investigated the composition of constitutive heterochromatin in mouse tissues. Therefore, we optimized a protocol for native and unbiased isolation of heterochromatin clusters from mouse tissues and combined it with a quantitative mass spectrometry approach. We identified and validated previously unknown proteins along with proteins known to be involved in constitutive heterochromatin cluster formation and function. We observed differing heterochromatin organization between tissues and identified heterochromatin proteins with distinct abundance between mouse brain and liver tissue. Especially MeCP2, ATRX, and histone H1 might play a role in the distinct heterochromatin organization between tissues, but also newly identified candidate heterochromatin proteins could be involved. We found the methyl-CpG binding protein (MeCP2) enriched in the mouse brain. It binds to methylated cytosines on the DNA, recruits numerous chromatin-associated factors, and was shown to induce dose-dependent heterochromatin reorganization during terminal differentiation. Mutations in the MECP2 gene were associated with the neurological disorder Rett syndrome and altered protein levels were reported to cause disease phenotypes. Thus, we quantified MeCP2 levels in mouse brain nuclei and a cellular system upon exogenous expression of Mecp2-GFP. We showed that the level of MeCP2 in mouse brains is similar to its level in low transfected cells in our cellular system. In addition, we estimated the MeCP2 protein concentrations in the cell nucleus and heterochromatin compartments. We established a system that enables us to adjust the MeCP2 level of in cellulo and in vitro experiments to the in vivo protein level, thus ensuring comparability of experimental results to the physiological situation. Heterochromatin organization and its function are not only regulated by the proteins involved and their levels, but also by post-translational modifications of chromatin proteins. Hence, we isolated MeCP2 from the adult mouse brain and analyzed its modifications by mass spectrometry. We identified various post-translational modifications on MeCP2 and confirmed the influence of arginine methylation and to a lesser extent serine phosphorylation on MeCP2-mediated heterochromatin organization in a cellular system. Coexpression of arginine methyltransferases 1 and 6 lead to a decrease in heterochromatin clustering. Interestingly, we identified the Rett syndrome mutation R106 as a possible dimethylation site, implicating a role of MeCP2 post-translational modifications in the pathology of Rett syndrome. In summary, our data contribute to a better understanding of the constitutive heterochromatin organization in cells and its role in disease development.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Im Zellkern ist die DNA zusammen mit verschiedenen anderen Faktoren zu Chromatin gepackt, das in aktive und inaktive Kompartimente unterteilt wird, die Euchromatin und Heterochromatin genannt werden. Die Aufrechterhaltung des stillgelegten und dicht gepackten Zustandes des Heterochromatins ist äußerst wichtig, da es für die Genomstabilität und die räumliche Organisation der Kernkompartimente von wesentlicher Bedeutung ist und eine Fehlfunktion zu schwerwiegenden Beeinträchtigungen zellulärer Prozesse führen kann. Heterochromatin besteht aus fakultativem Heterochromatin, das in bestimmten Situationen aktiv wird, und konstitutivem Heterochromatin, das meist stillgelegt und dauerhaft verdichtet ist. Konstitutives Heterochromatin aus (peri)zentromerischen Regionen verschiedener Chromosomen lagert sich in der Interphase in Mauszellen zu Heterochromatinclustern zusammen. Da der Mechanismus der Bildung von konstitutivem Heterochromatin und die an diesem Prozess beteiligten Faktoren noch nicht vollständig geklärt sind, untersuchten wir die Zusammensetzung des konstitutiven Heterochromatins in Mausgeweben. Dazu optimierten wir ein Protokoll zur nativen und unvoreingenommenen Isolierung von Heterochromatinclustern aus Mausgeweben und kombinierten es mit einer quantitativen Massenspektrometriemethode. Wir identifizierten und validierten bisher unbekannte und bekannte an der Bildung und Funktion von Heterochromatinclustern beteiligte Proteine. Wir beobachteten eine variierende Organisation des Heterochromatins in verschiedenen Geweben und identifizierten Heterochromatinproteine mit unterschiedlicher Abundanz im Gehirn- und Lebergewebe der Maus. Insbesondere MeCP2, ATRX and Histon H1 könnten eine Rolle bei der gewebespezifisch unterschiedlichen Organisation des Heterochromatins spielen, aber auch neu identifizierte Kandidaten für Heterochromatinproteine sind möglicherweise beteiligt. Wir identifizierten das Methyl-CpG-bindende Protein 2 (MeCP2) als angereichert im Gehirn der Maus. Es bindet an methylierte Cytosine auf der DNA, rekrutiert zahlreiche Chromatin-assoziierte Faktoren und es wurde gezeigt, dass es während der terminalen Differenzierung dosisabhängig Heterochromatin-Clusterbildung induziert. Mutationen im MECP2-Gen wurden mit der neurologischen Erkrankung Rett-Syndrom in Verbindung gebracht und es wurde beschrieben, dass auch Veränderungen der Proteinkonzentration Krankheitssymptome verursachen können. Daher haben wir die MeCP2-Konzentration in Zellkernen aus dem Mausgehirn sowie in einem zellulären System nach Expression von Mecp2-GFP quantifiziert. Wir konnten zeigen, dass die MeCP2-Konzentration im Mäusegehirn der Konzentration in niedrig transfizierten Zellen in unserem zellulären System ähnelt. Darüber hinaus haben wir die MeCP2-Proteinkonzentrationen im Zellkern und in Heterochromatin-Kompartimenten bestimmt. Wir haben ein System entwickelt, das es ermöglicht, das MeCP2-Level von in cellulo und in vitro Experimenten an die in vivo Proteinkonzentration anzupassen und so die Vergleichbarkeit der experimentellen Ergebnisse mit der physiologischen Situation sicherzustellen. Die Organisation des Heterochromatins und seine Funktion werden nicht nur durch die beteiligten Proteine und ihre Konzentration, sondern auch durch posttranslationale Modifikationen von Chromatinproteinen reguliert. Daher isolierten wir MeCP2 aus dem Gehirn erwachsener Mäuse und analysierten seine Modifikationen mittels Massenspektrometrie. Wir identifizierten verschiedene posttranslationale Modifikationen und bestätigten den Einfluss von Argininmethylierung und Serinphosphorylierung auf die MeCP2-vermittelte Heterochromatinorganisation in einem zellulären System. Die Koexpression der Arginin-Methyltransferasen 1 und 6 führte zu einer Abnahme der Heterochromatin-Clusterbildung. Interessanterweise identifizierten wir die Rett-Syndrom Mutation R106 als mögliche Dimethylierungsstelle, was auf eine Rolle der posttranslationalen Modifikationen von MeCP2 bei der Pathologie des Rett-Syndroms hindeutet. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass unsere Daten zu einem besseren Verständnis der Organisation des konstitutiven Heterochromatins in Zellen und seiner Rolle bei der Entstehung von Krankheiten beitragen.

German
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-229610
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 10 Department of Biology > Cell Biology and Epigenetics
Date Deposited: 19 Jan 2023 13:01
Last Modified: 23 Jan 2023 07:02
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/22961
PPN: 503961280
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