Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) sind eine vielversprechende und schnell wachsende Klasse innerhalb der zielgerichteten Krebstherapeutika. Sie bestehen aus hochwirksamen Chemotherapeutika, die kovalent an monoklonale Antikörper (mAbs) gebunden sind, welche das Chemotherapeutikum zu den Krebszellen transportieren. Das Konzept der gezielten Zustellung eines Chemotherapeutikums über ein ADC ermöglicht eine verbesserte therapeutische Wirksamkeit und Sicherheit im Vergleich zu den einzelnen Komponenten eines ADC - dem mAb und dem zytotoxischen Wirkstoff. Obwohl bereits verschiedene ADCs erfolgreichen zugelassen wurden, ist deren Entwicklung komplex und mit einem hohen Risiko kostspieliger Fehlschläge in späten Entwicklungsstadien verbunden. Es hat sich gezeigt, dass das Gesamtdesign eines ADCs und ebenso jede einzelne Komponente die kritischen physikochemischen Eigenschaften des ADCs beeinflussen können, was wiederum zu einer schnellen unspezifischen Clearance der ADCs führen kann. Eine erhöhte unspezifische Clearance kann sich direkt auf die Wirksamkeit und Sicherheit auswirken und das therapeutische Fenster des ADCs verkleinern. Um dieses Problem zu adressieren, war das Ziel dieser Studie Methoden zu bewerten mit denen sich physikochemische Eigenschaften von ADCs analysieren lassen und die genutzt werden könnten, um auf ein Risiko für eine schlechte Pharmakokinetik (PK) der ADCs hinzuweisen. Diese Methoden wurde auf eine Serie von ADCs angewandt, um zu bewerten, ob die Hydrophobizität (Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)) und thermische Stabilität (nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF)) der ADCs sowie das Bindungsverhalten an den human neonatalen Fc-Rezeptor (huFcRn; huFcRn Bindungskinetik mittels Bio-Layer-Interferometrie (BLI)) Hinweise auf die PK der ADCs geben können, die in huFcRn-transgenen Tg276-Mäusen analysiert wurden. Zu diesem Zweck wurden acht Trastuzumab-basierte ADCs mit einer homogenen DAR von 2 (Wirkstoff-Antikörper-Verhältnis von 2) hergestellt. Die Konjugation erfolgte entweder an Cysteine, die genetisch an den Positionen N325, L328, S239, D265 oder S442 eingefügt wurden, oder enzymatisch mittels mikrobieller Transglutaminase (mTG) entweder an C-terminale Erkennungsmotive der leichten (LC) oder schweren Kette (HC) oder an die endogene Position Q295 des nativen Antikörpers. Interessanterweise wurden deutliche Unterschiede in den PK-Profilen der ADCs beobachtet, die es ermöglichten die kürzlich beschriebene Position L328 als geeignete Stelle für die Cystein-Konjugation zu bestätigen, vergleichbar mit der gut etablierten Position S239. Darüber hinaus ermöglichte dies die Eignung der Position Q295 des nativen Antikörpers und der mit Erkennungsmotiv generierter LC-Antikörpervariante für enzymatische Konjugationen via mTG hervorzuheben. Um zu untersuchen, ob die Auswirkungen der Konjugationsstelle und -methode auch für andere Antikörpergerüste als Trastuzumab gelten, wurden zwei der Positionen, L328 und die mTG-LC-Variante, zusätzlich im Zusammenhang mit den klinisch evaluierten mAbs Briakinumab und Secukinumab bewertet. Dabei zeigte sich, dass auch bei den Briakinumab- und Secukinumab-basierten Varianten der Einfluss der Konjugationsstellen und Methoden auf die PK zu einer gleichen Rangfolge in der PK führte. Für alle ADCs wurden Daten zu ihren physikochemischen Eigenschaften mit den oben genannten Methoden erhoben und mit der ADC Clearance korreliert, da die Clearance (CL) ein wichtiger PK-Parameter ist. Interessanterweise wurde jedoch eine ähnliche huFcRn-Bindung und unterschiedlich ausgeprägte Hydrophobizität und thermische Stabilitäten beobachtet, die nicht mit den CL-Werten der ADCs korrelierten. Folglich wurden in dieser Studie zusätzliche Methoden auf ihre Eignung als Indikator für ein schlechtes PK-Verhalten von ADCs untersucht, die aus verschiedenen Berichten adaptiert wurden, in denen sie eine Vorhersage der schlechten PK von mAbs ermöglichten. Um eine robustere Korrelation zwischen der PK und den Ergebnissen der In-vitro Methoden zu ermöglichen, wurden 13 ADCs verwendet, die sich nicht nur in der Konjugationsposition und Konjugationsmethode, sondern auch in ihrer DAR und dem Antikörpergerüst unterschieden und für die in hemizygoten huFcRn-Tg276-Mäusen ein breites Spektrum an CL-Werten (1,18-8,38 ml/h/kg) beobachtet wurde. Die unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften dieser ADCs wurden mittels sieben verschiedener Methoden bewertet. Diese wurden implementiert, um entweder den Grad der Selbstassoziation (Klon-Selbstinteraktions Bio-Layer-Interferometrie (CSI-BLI) und Affinity Capture Selbstinteraktions-Nanopartikel-Spektroskopie (AC-SINCS)), der unspezifischen Bindung (Polyspezifitätsreagenz Bio-Layer-Interferometrie (PSR-BLI), Baculoviren-Partikel (BVP) und Heparin-Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA)), der Hydrophobizität (bis-ANS) oder der huFcRn-Bindung (huFcRn-Affinitäts-Chromatographie) der ADCs zu analysieren. Die Daten aus den Analysen wurden für die Korrelation mit den CL-Werten verwendet. Insgesamt zeigten ADCs mit niedriger CL auch niedrigere Ergebnisse in den Tests, während im Vergleich dazu ADCs mit schneller CL (in etwa >4 ml/h/kg) höhere Test-Ergebnisse aufwiesen. Diese Ergebnisse deuten zum ersten Mal darauf hin, dass die ausgewählten In-vitro-Methoden ein leistungsfähiges Instrument für die frühe Entwicklung nicht nur von mAbs, sondern auch von ADCs sein könnten, da sie ermöglichen ADCs mit günstigen PK-Eigenschaften auszuwählen. Folglich könnte die Anwendung dieser In-vitro-Methoden als Screening-Paradigma für die PK-Risikominimierung während der frühen ADC-Entwicklung dienen. Allerdings sind noch weitere Arbeiten erforderlich, um den Datensatz zu erweitern und robuste statistische Analysen durchzuführen, die als Grundlage für die Festlegung von Grenzwerten für jeden Assay dienen könnten.