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From acute to persisting damage: CHK2 is crucial for sustaining the p53 response

Friedel, Laura (2022)
From acute to persisting damage: CHK2 is crucial for sustaining the p53 response.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00021798
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: From acute to persisting damage: CHK2 is crucial for sustaining the p53 response
Language: English
Referees: Löwer, Prof. Dr. Alexander ; Löbrich, Prof. Dr. Markus
Date: 2022
Place of Publication: Darmstadt
Collation: VI, 114 Seiten
Date of oral examination: 29 April 2022
DOI: 10.26083/tuprints-00021798
Abstract:

The choice between life and death is one of the most vital decisions a cell has to make when challenged with different sources of stress. This choice is confounded by variable cellular states, which change throughout the stress response due to both, input from the environment and countermeasures initiated by the cell. The transcription factor p53 is a crucial player orchestrating the cellular response to DNA damage. It not only decides whether a cell should live or die, but it also arrests the cell cycle to provide time for the DNA repair machinery to restore the integrity of the genome. In response to DNA double-strand breaks, p53 shows a series of uniform pulses of accumulation lasting over several hours. In this time, the status of the genome is changing significantly: While during the first pulse the cell is challenged with newly emerged breaks, during the second and the following pulses many breaks have been repaired with only complex breaks and lesions in heterochromatic regions remaining. In this thesis, I investigated whether this change in the status of the genome is reflected in the p53 response. Using live-cell microscopy and pharmacological inhibitors, I provide evidence that the immediate response to acute damage and the sustained response to persisting damage are mediated by two different though interconnected upstream signals: The kinase ATM is crucial to initiate the p53 response and to respond to new DNA damage detected by the cell. Furthermore, active ATM is essential for the initial activation of the checkpoint kinase CHK2. However, sustained activity of ATM is dispensable for both, sustained oscillations of p53 and maintaining CHK2 activity. In contrast, continuous input by CHK2 is crucial for sustaining the p53 response. I could provide first indications that CHK2 modulates p53 levels by inducing the degradation of the negative regulator MDMX thereby destabilizing MDM2. To investigate the impact of these different upstream networks on p53’s function as a transcription factor, the posttranslational modification (PTM) state, kinetics of promoter binding and target gene transcription were assessed for the immediate response (1st pulse) and the sustained response (2nd pulse). I could show that p53’s PTM state changes between the first and second pulse. Comparing the binding of p53 across different loci, no gene-specific patterns of promoter binding were observed. However, we observed gene-specific patterns of transcription which varied particularly for the second pulse. By altering the time-varying PTM state of p53, we were able to modulate both promoter binding and gene-specific patterns of target gene transcription. All in all, I provide evidence that the immediate and the sustained p53 response are mediated by different upstream signals inducing time-varying posttranslational modifications that in turn modulate target-specific gene transcription. Consequently, my work provides first indications that different molecular barcodes might allow differentiating between acute and persisting breaks.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die Wahl zwischen Überleben und Tod ist eine der zentralen Entscheidungen, die Zellen in Gegenwart von verschiedenen Stressoren treffen müssen. Diese Wahl ist umso heikler, da die Grundlage der Entscheidung, der Zustand der Zelle selbst, sich im Laufe der zellulären Stress-Antwort fortwährend verändert. Dies liegt zum einen daran, dass zusätzliche Einflüsse aus der Umwelt die Prozesse beeinflussen können. Zum anderen initiiert die Zelle selbst Gegenmaßnahmen, um potenziell gefährliche Auswirkungen abwehren zu können. Der Transkriptionsfaktor p53 ist ein wichtiger Teil der zellulären Stress-Antwort: Er koordiniert die Reaktion auf DNA-Schäden und entscheidet darüber, ob eine Zelle überlebt oder sterben muss. Darüber hinaus kann er auch ein Anhalten des Zellzyklus initiieren, um ausreichend Zeit zu schaffen, in der die DNA-Reparaturmaschinerie die Integrität des Genoms wiederherstellen kann. Wenn DNA-Doppelstrandbrüche in der Zelle auftreten, zeigt p53 eine Serie von gleichförmigen Pulsen der Akkumulation, welche je nach Schadensdosis über mehrere Stunden anhalten können. In dieser Zeit verändert sich der Zustand des Genoms signifikant: Während im Verlauf des ersten Pulses eine Vielzahl an neuen DNA-Brüchen vorlag, sind viele dieser Brüche während des zweiten Pulses bereits repariert und nur komplexe Brüche sowie Läsionen in Regionen des Heterochromatins verbleiben. In dieser Dissertation habe ich untersucht, wie sich diese Veränderung im Zustand des Genoms in der p53 Antwort widerspiegelt. Unter Verwendung von Lebendzell-Mikroskopie und pharmakologischen Inhibitoren konnte ich zeigen, dass die unmittelbare p53 Antwort auf akuten Schaden und die anhaltende Antwort auf bestehende Schäden durch zwei unterschiedliche jedoch vernetzte vorgeschaltete Signale vermittelt werden: Die Kinase ATM ist entscheidend, um die p53 Antwort zu initiieren und auf neu detektierte DNA-Schäden zu reagieren. Darüber hinaus ist aktives ATM essenziell für die initiale Aktivierung der checkpoint Kinase CHK2. Eine fortwährende Aktivierung von ATM ist allerdings entbehrlich sowohl für anhaltende Oszillationen von p53 als auch für die Aufrechterhaltung von aktivem CHK2. Im Gegensatz dazu war kontinuierliche Aktivität von CHK2 jedoch essenziell, um andauernde p53 Pulse zu generieren. In ersten Experimenten konnte ich zeigen, dass CHK2 die p53 Level moduliert, indem es die Degradierung des negativen Regulators MDMX induziert und so MDM2 destabilisiert. Um herauszufinden, wie diese verschiedenen Netzwerke die Funktion von p53 als Transkriptionsfaktor beeinflussen, wurden seine posttranslationalen Modifikationen (PTM), die Kinetiken der Promotor-Bindung sowie die Transkription der Zielgene während der unmittelbaren Antwort (1. Puls) und der anhaltenden Antwort (2. Puls) untersucht. Ich konnte zeigen, dass die vorliegenden PTM zwischen dem ersten und dem zweiten Puls wechseln. Ein Vergleich der Bindung von p53 an Promotoren der verschiedenen Zielgene zeigte keine Gen- spezifischen Muster. Allerdings beobachteten wir Gen-spezifische Muster bei der Transkription. Hierbei traten die Unterschiede vorrangig während des zweiten Pulses auf. Durch Veränderung der vorliegenden PTM konnten wir sowohl die Promotor-Bindung als auch die spezifischen Transkriptionsmuster modulieren. Alles in allem zeige ich in dieser Arbeit, dass die unmittelbare und die anhaltende p53 Antwort durch verschiedene vorgeschaltete Signale vermittelt werden. Diese Signale wiederum induzieren spezifische PTM, die infolgedessen im Verlauf der Antwort variieren und die Transkription spezifischer Zielgene beeinflussen. Somit zeigt meine Arbeit, dass mithilfe von solchen molekularen Barcodes zwischen neuem, akutem Schaden und bereits vorhandenem Schaden unterschieden werden kann.

German
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-217982
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 10 Department of Biology > Systems Biology of the Stress Response
Date Deposited: 08 Aug 2022 12:07
Last Modified: 16 Dec 2022 15:10
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/21798
PPN: 499062663
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