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Analyse von Atmungskettenkomplexen aus Organellen von Chlamydomonas reinhardtii und Rattus norvegicus

Schwaßmann, Helena J. :
Analyse von Atmungskettenkomplexen aus Organellen von Chlamydomonas reinhardtii und Rattus norvegicus.
TU Darmstadt, Clemes-Schöpf-Institut für Organische Chemie und Biochemie
[Ph.D. Thesis], (2010)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Analyse von Atmungskettenkomplexen aus Organellen von Chlamydomonas reinhardtii und Rattus norvegicus
Language: German
Abstract:

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Anordnung mitochondrialer Atmungskettenkomplexen zu sogenannten Superkomplexen und mit der aus Chloroplasten stammenden FoF1-ATP-Synthase. Hierbei wird insbesondere die Veränderung in der Oligomerisierung der FoF1-ATP-Synthase sowie in der Superkomplexbildung durch veränderten Metabolismus (Chlamydomonas reinhardtii) und durch den Einfluss des Alterns (Rattus norvegicus) untersucht. Das Mitochondrium ist als das Kraftwerk der Zelle bekannt, denn es beherbergt neben den Enzymen des Citratzyklus und der Fettsäuresynthese auch die fünf Proteinkomplexe der Atmungskette in ihrer inneren Membran. Vier dieser Komplexe bilden die Elektronentransportkette und bewerkstelligen die Übertragung der Elektronen von den Redoxequivalenten NADH und FADH2 auf molekularen Sauerstoff, während drei von ihnen gleichzeitig einen Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran aufbauen. Dieser elektrochemische Protonengradient treibt die ATP-Synthase an. Etwa 90% des ATPs, das aerobe, eukaryotische Organismen verbrauchen, wird auf diese Weise generiert; dies verdeutlicht die essentielle Wichtigkeit dieser Enzymkomplexe. Die Atmungskettenkomplexe selbst liegen nicht, wie früher allgemein, und von vielen auch heute noch angenommen, einzeln und lateral frei beweglich in der Membran vor, sondern sie lagern sich zu verschiedenen Superkomplexen zusammen. In dieser Arbeit werden mittels blau-nativer und mehrdimensionaler Gelelektrophorese sowie durch Antikörper- und Aktivitätsuntersuchungen und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie erstmalig die Atmungskettensuperkomplexe aus Mitochondrien der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii beschrieben. Anders als alle bisher untersuchten Pflanzen bildet die Alge keinen Superkomplex a aus, der aus Komplex I (NADH:Ubiquinon-Oxidoreductase) und einem Dimer von Komplex III (Ubiquinol:Cytochrom-c-Oxidoreductase) besteht. Dagegen bildet die Alge nur zwei Atmungskettensuperkomplexe S1 und S2, die zusätzlich Komplex IV (Cytochrom-c-Oxidase) enthalten und die Stöchiometrie I1III2IV1 und I1III2IV2 besitzen; somit entsprechen sie den zuerst für Rinderherz beschriebenen Superkomplexen b und c. Die entwickelte Methodik der Gewinnung des Superkomplexes S1 (I1III2IV1) ermöglichte seine erste elektronenmikroskopische Darstellung. Neben der mitochondrialen ATP-Synthase besitzt Chlamydomonas reinhardtii eine weitere ATP-Synthase des FoF1-Typs in ihren Chloroplasten (CFoF1). Dieses Enzym ist die bislang einzige nicht-mitochondriale ATP-Synthase, für die Dimere nachgewiesen wurden. In der vorliegenden Arbeit wird durch die in vivo Markierung der Algen mit dem stabilen Stickstoffisotop 15N und einer quantitativen massenspektrometrischen Analyse gezeigt, dass die Dimerisierung der CFoF1 vom metabolischen Zustand der Zelle abhängig ist. Sie kann also - anders als mitochondriale ATP-Synthase-Dimere - eine regulatorische Funktion besitzen, die möglicherweise die ATP-Produktion der Chloroplasten herunterregelt, wenn die Zelle andere Nahrungsquellen nutzt. Der Anteil an Dimeren in Zellen, die photomixotroph wachsen, also ihre Energie aus Licht und organischen Molekülen gewinnen, liegt um das 2,5-fache höher als in den ebenfalls untersuchten photoautotrophen Zellen, die ihre Energie ausschließlich aus der Photosynthese beziehen. Eine weitere in dieser Arbeit beschriebene vergleichende quantitative Proteomanalyse wird an Ratten dreier verschiedener Altersgruppen durchgeführt. Die Atmungskettenkomplexe und Superkomplex-Zusammensetzungen wurden durch Antikörperanalysen und durch ein- und mehrdimensionale sowohl blau-native als auch denaturierende Gelelektrophorese quantifiziert. Die Experimente zeigen eine Abnahme des Gehalts an Komplex III und V im Bezug auf den Gesamtproteingehalt, im Fall von Komplex III als eine stufenweise Abnahme über die drei Altersgruppen hinweg.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The thesis studies the assembly of mitochondrial respiratory chain complexes to “supercomplexes”, as well as the chloroplast F-Type ATP-Synthase. Especially oligomerization of the latter in chloroplasts of Chlamydomonas reinhardtii at different metabolic conditions, respiratory chain supercomplexes of this organism, and changes in the formation of supercomplexes due to the influence of ageing in Rattus norvegicus are investigated. The respiratory chain is not, as formerly claimed, composed of individual laterally freely movable complexes, but forms different quinary structures called supercomplexes. In this thesis the respiratory chain supercomplexes of Chlamydomonas reinhardtii are investigated using blue-native polyacrylamide gel electrophoresis, two- dimensional electrophoresis, western blots, and MALDI mass spectrometry. The most abundant supercomplexes found in this organism are composed of the individual complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase), a dimer of complex III (Ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase), and one or two copies of complex IV (cytochrome c oxidase). Additionally to the mitochondrial F-Type ATP-Synthase, which forms a stable dimer in Chlamydomonas reinhardtii, the organism harbours another F-Type ATP-synthase in its chloroplasts, which is the only chloroplast enzyme of this kind known to form dimmers. This work describes the in vivo metabolic labelling with 15N of the algae to quantify via mass spectrometry changes in dimerization of chloroplast F-Type ATP-synthase dependent on the metabolic state of the cells. A 2.5 fold increase of dimerization was found in cells grown under mixotrophic conditions as compared to cells grown photoautotrophically. The quantitative change of the assembly of respiratory chain complexes to supercomplexes in rats of three different age groups is another focus of this thesis. Analysis is performed using western-blot, blue native and denaturing gel electrophoresis. The experiments show an age-dependent decrease in the overall amount of complex III and V.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Fachbereich Chemie > Biochemie
Date Deposited: 02 Jun 2010 06:52
Last Modified: 07 Dec 2012 11:57
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-21508
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Dencher, Prof. Dr. Norbert A. and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 7 May 2010
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2150
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