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Along with steadily increasing interest in biopharmaceuticals such as peptides, proteins, or nucleic acids, development of strategies for their effective cytosolic delivery gained comparable attention. Indeed, being very potent in frames of bioactivity, these macromolecules do not readily enter the cytosol. Therefore, their application field is often restricted to extracellular targets. To overcome this limitation, and to achieve the ability to address intracellular targets, different approaches have been done aiming at improved cellular uptake. Beside strategies based on delivery of macromolecules with liposomes,[28-29] polymersomes,[30] nanoparticles,[32] or pore-forming proteins,[35-36] cell-penetrating peptides have emerged as a versatile tool for intracellular delivery of different cargoes. In particular, arginine-rich CPPs and their even more potent cyclic versions have numerously been reported as efficient delivery vehicles.[50, 52]
In the frame of the present work, a system for efficient cytosolic delivery of biomolecular cargo was developed, based on CPP-bearing dextran hybrids. The initial study was focused on two arginine-free peptides. The 13 amino acid antimicrobial peptide aurein1.2 has been reported[68] to enhance cytoplasmic delivery by mediating endosomal escape of endocytosed proteins. The cationic amphiphilic 25 amino acid peptide L17E, a variant of haemolytic M lycotoxin with diminished cytotoxicity, was reported[56] to promote cytosolic uptake of different functional proteins up to full-length antibodies. So far, L17E-mediated cargo delivery was induced upon co-incubation with the peptide merely, and no efforts have been made to introduce a covalent linkage between both components, peptide and cargo. In the present study, both aurein1.2 and L17E were not able to promote cellular uptake when covalently linked to model conjugate in single unit. Hence, it remained to be investigated, whether an uptake-increasing multivalency effect could be generated by linkage of the respective peptide on a suitable scaffold in multiple copies.
Comprising α-(1-6) glycosidic bonds between D-glucose repeating units, biocompatible dextran polysaccharide has already been reported as a suitable hydrophilic scaffold for the generation of high-DAR antibody-drug conjugates[76] or multivalent platform for DR5-induced apoptosis.[78] The hydroxy groups of the glucose repeating units as well as the polysaccharide reducing end offered possibilities for multivalent functionalization of dextran.[61, 76, 78] Therefore, 10 kDa dextran was chosen as platform for covalent oligomerization of cell-penetrating peptides aurein1.2 and L17E. To this end, amine functionality was introduced to the polysaccharide reducing end via reductive amination and the hydroxy groups of the glucose repeating units were modified via carboxyethylation. Subsequent conversion of the introduced carboxyl moieties into either maleimide- or azide-functionalities enabled peptide and/or cargo conjugation via maleimide-thiol addition or Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition.
Decoration of maleimide-functionalized dextran polysaccharide with multiple copies of aurein1.2, respectively L17E, and a fluorescent label gave peptide-dextran hybrids, whose intracellular distribution was analyzed upon uptake in HeLa cells. L17E-dextran hybrid showed considerable superior uptake compared to the aurein1.2 variant. HeLa cells treated with TAMRA-labeled and L17E-decorated dextran module 37 at low micromolar concentration showed effective uptake of the macromolecule with fluorescence signals spread all over the cytosol and even nucleus (Figure 37, Figure 92). Furthermore, TAMRA-labeled dextran 37, covalently decorated with on average 3.8 L17E units, showed increased uptake compared to a TAMRA-labeled dextran co-incubated with solitary L17E peptide, as reported in the literature.[56] These encouraging findings led to development of a strategy for intracellular delivery of various cargo beyond fluorophore molecules, applying L17E-dextran hybrid as delivery module.
A possible cytotoxic effect of L17E-dextran module was assessed, applying dextran 42, decorated with on average 4.8 L17E peptide units. In the taken cell line, an IC50 value of approximately 10 µM (Figure 41) was determined, which was rather low and in an acceptable range when taken into consideration that L17E was derived from naturally haemotoxic lycotoxin.
L17E-dextran mediated cytosolic and nuclear delivery of peptide nucleic acid (PNA) was validated by mis-splicing correction assay in appropriate HeLa cells, stably transfected with enhanced green-fluorescent protein (eGFP) gene. Therefore dextran 43 was equipped with multiple copies of both L17E and PNA. The L17E-dextran module was able to deliver bioactive PNA into the nucleus of HeLa cells, whereupon the cargo PNA induced mis-splicing correction, leading to enhanced GFP fluorescence (Figure 45). This validated not only cytosolic, but even nuclear translocation of L17E-dextran module. Furthermore, the potential of dextran, equipped with multiple L17E peptides, was demonstrated to mediate intracellular uptake of PNA, that in general lacks cellular permeability and is not efficiently taken up by cells.
Finally, L17E-dextran module showed its ability to promote intracellular delivery of covalently conjugated protein cargo. To this end, a construct was designed, combining eGFP as model protein with L17E-decorated dextran serving as cytosolic uptake-promoting module. Synthesis was performed via iEDDA conjugation of a norbornene-functionalized dextran, bearing multiple orthogonal azide moieties, to a methyltetrazine-modified eGFP protein, followed by CuAAC “click” with alkyne-modified L17E peptide. At low micromolar concentration, yielded L17E-dextran-eGFP 44 was efficiently taken up by HeLa cells, visualized by widely spread and homogenic eGFP fluorescence inside the cytosol (Figure 52).
In conclusion, decoration of dextran polysaccharide with multiple copies of L17E peptides resulted in peptide-dextran hybrid, acting as a versatile uptake-mediating module. L17E-dextran promoted cytoplasmic delivery of covalently conjugated biomolecular cargo at low micromolar concentration without largely compromising cell viability. L17E has already been reported to promote cytosolic uptake of proteins, up to full-length antibodies, upon simple coincubation of solitary L17E peptide with the cargo.[56] However, uptake-mediating ability was improved via combining the oligomerization of L17E peptide on polysaccharide scaffold with the introduction of covalent connections between all counterparts: peptide, cargo, and dextran. In this way, a modular delivery system was established, which enabled intracellular delivery of various cargo, from PNA to proteins. Dependent on type and nature of the cargo, the multifunctionalized dextran backbone could be decorated following two strategies (Figure 59): One possibility included decoration of glucose repeating units with multiple copies of L17E and with multiple copies of cargo molecules simultaneously, while a further conjugation site at the reducing end remained accessible for conjugation of a potential second type of cargo. This option seemed to be beneficial for delivery of cargo such as peptides or PNA. The second possibility was based on decoration of the glucose repeating units with multiple L17E only, while the cargo was conjugated to the polysaccharide reducing end. The latter option seemed to be most suitable for more bulky cargo, such as proteins.
In addition to the encouraging results of this proof-of-concept studies, several issues remain to be investigated. For solitary L17E co-incubation-mediated cytoplasmic cargo delivery an uptake mechanism was proposed based on transient membrane permeabilization. L17E was thought to induce actin rearrangement upon interaction with the cell membrane, leading to membrane ruffling followed by macropinocytosis. Before macropinosome formation was accomplished, L17E assumedly ruptured the ruffled membrane, thus paving the way of direct cargo entry into the cytoplasm.[70] It remains to be ascertained, whether the same mechanism is appropriate for L17E in its dextran-conjugated state.
Moreover, regarding L17E-dextran mediated delivery of covalently conjugated protein cargo, it remains to substitute eGFP model protein with a functional biomolecule of interest. A broad range of intracellular targets exist, whose specific binding or functional blocking could be of interest in a therapeutic context. Single-domain antibodies, also called nanobodies, could be ideal candidates for addressing intracellular targets. Therefore, cytosolic delivery of these macromolecules would be of great importance and in the future, potentially could be realized via site-specific conjugation to L17E-dextran delivery module. |
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In den vergangenen Jahrzehnten hat das Interesse an der Entwicklung von therapeutischen Wirkstoffen, die auf biologischen Molekülen wie Peptiden, Proteinen oder Nukleinsäuren basieren, zunehmend an Bedeutung gewonnen. Damit einhergehend erweckte auch die Entwicklung von Strategien für einen effektiven Transport in das Zellinnere zunehmend an Aufmerksamkeit, da diese auf Biomakromolekülen basierenden Wirkstoffe meist nicht in der Lage sind die Zellmembran zu überwinden und in das Zytosol zu gelangen. Aus diesem Grund sind Biopharmazeutika in ihrer Anwendung häufig auf extrazelluläre Ziele begrenzt. Um diese Restriktion zu überwinden und auch intrazelluläre Anwendung zu ermöglichen, wurden bereits verschiedene Strategien zum verbesserten Transport diverser Biomakromoleküle in das Zytosol entwickelt. Neben Herangehensweisen, die auf Verwendung von Liposomen,[28-29] Polymersomen,[30] Nanopartikeln[32] oder porenbildenden Proteinen[35-36] basieren, hat sich auch der Einsatz sogenannter zellpenetrierender Peptide (cell-penetrating peptides CPPs) zum Transport von Biomakromolekülen in das Zytosol lebender Zellen als effektiv erwiesen. Vor allem CPPs, die eine Vielzahl an Argininen beinhalten, und insbesondere deren zyklisierte Varianten, stellen ein effektives Transportsystem dar.[50-51]
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein System zum effizienten Transport von Biomolekülen in das Zytosol von Säugerzellen entwickelt, das auf CPP-dekorierten Dextran Hybriden basiert. Zu Beginn der Entwicklung wurden zwei Arginin freie Peptide in Betracht gezogen: Das antimikrobielle 13 Aminosäuren Peptid Aurein1.2 soll die intrazelluläre zytoplasmatische Darreichung von Proteinen, die nach endozytotischer Aufnahme in Endosomen eingeschlossen sind, dadurch verbessern, dass es die Überführung aus dem Endosom ins Zytosol erleichtert.[68] Das kationische amphiphile 25 Aminosäuren Peptid L17E ist eine durch Aminosäureaustausch generierte Variante des hämolytischen M-Lykotoxins mit verminderter Zytotoxizität und ermöglicht effektiven Transport verschiedener funktioneller Proteine, bis hin zu Volllängen-Antikörpern, ins Zytosol.[56] Bisher wurde die L17E vermittelte zytoplasmatische Darreichung von Proteinen lediglich durch Koinkubation des jeweiligen Proteins mit L17E Peptid erzielt. Anstrengungen, um eine kovalente Bindung zwischen beiden Komponenten einzuführen, wurden bisher noch nicht unternommen. Unter den in dieser Arbeit zu Grunde gelegten Bedingungen konnten jedoch sowohl Aurein1.2 als auch L17E, jeweils in einzelner Ausfertigung kovalent an ein Modelprotein gebunden, nicht dessen intrazelluläre Aufnahme induzieren. Daher blieb zu analysieren, ob durch Verknüpfung mehrerer Kopien des jeweiligen Peptids auf einem geeigneten Rückgrat ein Multivalenzeffekt hervorgerufen werden kann, der den Transport von Biomakromolekülen ins Zytosol begünstigt.
Das biokompatible Polysaccharid Dextran, bestehend aus vornehmlich α-(1-6) glycosidisch gebundenen D-Glukose Wiederholungseinheiten, wurde unter anderem bereits erfolgreich als hydrophiles Gerüst zur Erzeugung von high-DAR Antikörper-Wirkstoff Konjugaten[76] oder auch als multivalente Plattform für DR5-induzierte Apoptose[78] eingesetzt. Dextran bietet die Möglichkeit zur multivalenten Funktionalisierung, so können zum einen die Hydroxygruppen der Glukose Einheiten als auch das reduzierende Ende des Polysaccharids modifiziert werden.[61, 76, 78] Folglich wurde Dextran (10 kDa) als geeignete Plattform für die kovalente Oligomerisierung der zellpenetrierenden Peptide Aurein1.2 und L17E ausgewählt. Zu Beginn der Dextran Modifikation wurde mittels reduktiver Aminierung eine Aminfunktionalität am reduzierenden Ende eingeführt und anschließend die Hydroxygruppen der Glukose Wiederholungseinheiten durch Carboxyethylierung modifiziert. Durch Umwandlung der eingeführten Carboxygruppen in entweder Maleimid- oder Azid-Funktionalitäten, wurde die Konjugation von zellpenetrierendem Peptid und/oder von zu transportierendem Makromolekül durch Maleimid-Thiol Addition oder Cu(I)-katalysierter Azid-Alkin-Cycloaddition ermöglicht. Die Dekoration von Maleimid-funktionalisiertem Dextran mit mehreren Kopien von Aurein1.2 respektive L17E und einem Fluoreszenzfarbstoff ergab Peptid-Dextran Hybride, deren intrazelluläre Verteilung nach Aufnahme in HeLa Zellen analysiert wurde. TAMRA markiertes L17E-Dextran Hybrid zeigte im Vergleich zur mit Aurein1.2 ausgestatteten Variante eine deutlich gesteigerte Aufnahme. HeLa-Zellen, die mit TAMRA-markiertem und L17E-dekoriertem Dextran 37 in niedriger mikromolarer Konzentration inkubiert wurden, zeigten eine effektive Aufnahme des Makromoleküls mit gleichmäßig über das gesamte Zytosol verteilten und auch im Zellkern sichtbaren Fluoreszenzsignalen (Figure 37, Figure 92). Darüber hinaus zeigte TAMRA-markiertes Dextran 37, das kovalent mit durchschnittlich 3,8 L17E Einheiten ausgestattet war, verglichen mit TAMRA-markiertem Dextran, das wie in der Literatur[56] beschrieben mit solitärem L17E Peptid koinkubiert wurde, eine deutlich verbesserte Aufnahme in HeLa Zellen. Diese ermutigenden Ergebnisse führten zur Entwicklung einer Strategie, die unter Verwendung von L17E-Dextran den Transport von kovalent gebundenen Biomakromolekülen ins Zytosol von Säugerzellen ermöglichen sollte.
Eine mögliche zytotoxische Wirkung des L17E-Dextran Transportmoduls wurde unter Verwendung von Dextran 42 beurteilt, das mit durchschnittlich 4,8 L17E Peptideinheiten ausgestattet wurde. In der verwendeten HeLa Zelllinie wurde für L17E-Dextran 42 ein IC50 Wert von ungefähr 10 µM bestimmt. In Anbetracht dessen, dass L17E von natürlich vorkommendem, hämotoxischem M-Lykotoxin abgeleitet wurde, wurde dieser Wert als relativ gering und innerhalb eines akzeptablen Bereichs angesehen.
Die Validierung des L17E-Dextran vermittelten Transports von Biomakromolekülen ins Zytosol und darüber hinaus auch in den Zellkern von HeLa Zellen erfolgte durch Peptid-Nukleinsäuren (PNA) induzierte Korrektur von Fehlspleißen. Zu diesem Zweck wurde Dextran 43 mit mehreren Kopien von sowohl L17E als auch der benötigten PNA ausgestattet. Das L17E-Dextran Transportmodul war in der Lage die bioaktive PNA in den Zellkern der speziellen, mit eGFP Gen transfizierten HeLa Zellen zu transportieren, woraufhin dort die PNA vermittelte Korrektur des Spleißens zu verstärkter eGFP-Fluoreszenz führte (Figure 45). Dadurch wurde nicht nur die zytoplasmatische, sondern auch die nukleare Translokation des L17E-Dextran Transportmoduls bestätigt. Darüber hinaus zeigte sich auf diese Weise auch das Potential von L17E-dekoriertem Dextran prinzipiell als Transporter von PNA Molekülen zu dienen, die im Allgemeinen Zellmembran impermeabel und solitär nicht in der Lage sind Zytosol und Zellkern zu erreichen.
Schließlich demonstrierte das L17E-Dextran Transportmodul seine Fähigkeit zur Vermittlung intrazellulärer Aufnahme kovalent konjugierter Proteine. Dazu wurde ein Konstrukt entworfen, das L17E-dekoriertes Dextran, fungierend als Komponente zur Vermittlung zytoplasmatischer Aufnahme, mit eGFP als Modellprotein kombinierte. Die Synthese des Konstrukts wurde durch iEDDA-Konjugation eines Norbornen-funktionalisierten und gleichzeitig mit mehreren orthogonalen Azid-Funktionalitäten dekorierten Dextrans an ein Methyltetrazin-modifiziertes eGFP Protein realisiert. Im Anschluss daran wurden die Azid-Funktionalitäten des Dextrans durch CuAAC-„Klick“ mit Alkin-modifiziertem L17E-Peptid adressiert. Das daraus resultierende L17E-Dextran-eGFP 44 zeigte eine effektive intrazelluläre Aufnahme in HeLa-Zellen, die durch eine weit verbreitete und homogene eGFP-Fluoreszenz im Zytosol visualisiert wurde (Figure 52).
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die kovalente Dekoration von Dextran Polysaccharid mit mehreren Kopien von L17E Peptiden zu Peptid-Dextran Hybriden führte, die sich als vielseitiges Transportmodul zur Vermittlung intrazellulärer Aufnahme von Biomakromolekülen bewiesen. Bereits in geringer Konzentration vermittelte L17E-Dextran den Transport kovalent konjugierter Biomakromoleküle ins Zytoplasma, ohne dabei die Viabilität der Zellen maßgeblich zu beeinträchtigen. Es war bereits aus der Literatur[56] bekannt, dass L17E die zytoplasmatische Aufnahme von Proteinen bis hin zu Volllängen-Antikörpern durch einfache Koinkubation des entsprechenden Proteins mit solitärem L17E Peptid vermittelt. Diese Fähigkeit zur Vermittlung zytoplasmatischer Aufnahme konnte allerdings dadurch verbessert werden, dass Oligomerisierung des L17E Peptids auf einem Polysaccharid Rückgrat mit der gleichzeitigen Einführung kovalenter Bindungen zwischen allen beteiligten Komponenten, nämlich Peptid, Dextran und zu transportierendem Biomakromolekül, kombiniert wurde. Auf diese Weise konnte ein modulares System entwickelt werden, das die intrazelluläre Aufnahme verschiedener Biomakromoleküle wie PNA oder Proteine ermöglichte. Abhängig von der Art der zu transportierenden Makromoleküle konnte das multifunktionalisierte Dextran Rückgrat zwei unterschiedlichen Strategien folgend dekoriert werden (Figure 60). Eine Möglichkeit bestand darin die Glukose Wiederholungseinheiten gleichzeitig mit mehreren Kopien von L17E und mit mehreren Kopien von Frachtmolekülen auszustatten, während am reduzierenden Ende eine weitere potentielle Konjugationsstelle zugänglich blieb. Diese Variante schien besonders für den Transport kleinerer Makromoleküle wie Peptide oder PNA geeignet zu sein. Die zweite Möglichkeit bestand darin die Glukose Wiederholungseinheiten ausschließlich mit L17E auszustatten, während das zu transportierende Makromolekül an das reduzierende Ende konjugiert wurde. Diese Option eignete sich vor allem für den L17E-Dextran vermittelten Transport von Proteinen.
Basierend auf den vielversprechenden Ergebnissen dieser Proof-of-Concept Studie verbleiben einzelne Punkte, die noch weiterführend betrachtet werden sollten. So wurde für die durch L17E Koinkubation vermittelte zytoplasmatische Aufnahme von Makromolekülen ein Aufnahmemechanismus vorgeschlagen, der auf einer vorübergehenden Membranpermeabilisierung beruht. Es wurde angenommen, dass L17E durch Wechselwirkung mit der Zellmembran eine Aktinumlagerung induziert, die zu Membranrüschen und schließlich Makropinozytose führt. Bevor die Bildung von Makropinosomen abgeschlossen ist, durchbricht L17E vermutlich die gekräuselte Membran und ermöglicht so den direkten Eintritt von L17E und Makromolekül in das Zytoplasma.[70] Es bleibt zu überprüfen, ob ein ähnlicher Mechanismus auch für L17E zutreffend ist, das in mehrfacher Ausfertigung kovalent an Dextran gebunden ist.
Darüber hinaus sollte hinsichtlich der L17E-Dextran vermittelten zytoplasmatischen Aufnahme von kovalent konjugiertem Protein das eGFP Modellprotein durch ein geeignetes funktionelles Biomolekül ersetzt werden. Es existiert eine Vielzahl an intrazellulären Zielen, deren spezifische Bindung oder funktionelle Blockierung in einem therapeutischen Kontext von Interesse sein könnten. Deshalb könnten beispielsweise Einzeldomänenantikörper, auch Nanobodies genannt, ideale Kandidaten für die Adressierung intrazellulärer therapeutischer Ziele darstellen. Zu diesem Zweck wäre der Transport dieser Makromoleküle ins Zytoplasma der jeweiligen Zielzelle von großer Bedeutung und könnte in Zukunft eventuell durch ortsspezifische Konjugation an das L17E-Dextran Transportmodul realisiert werden. | German |
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