In den letzten Jahrzehnten haben monoklonale Antikörper (mAbs) ihren Wert als leistungsfähige biologische Moleküle für diagnostische und therapeutische Anwendungen unter Beweis gestellt und sind heute die erfolgreichste Klasse von Biologika. Obwohl die Immunisierung von Nagetieren in Kombination mit einer anschließenden Humanisierung standardmäßig zur Generierung von monoklonalen Antikörpern für den therapeutischen Einsatz angewandt wird, ist diese Technologie mit einigen Einschränkungen verbunden. Die humanen Antigene, welche für die Immunisierung verwendet werden, sind oft sequenzhomolog zum murinen Ortholog und daher weniger immunogen, was die Anzahl der potenziell adressierten Epitope einschränken kann. Daher wurde in den letzten Jahren die Immunisierung von Vögeln als potenzieller neuer Ansatz für die Generierung von monoklonalen Antikörpern erforscht. Aufgrund des evolutionären Distanz vom Huhn zum Menschen können zusätzliche Epitope adressiert werden, die bei der Verwendung von Nagetieren nicht targetiert werden könnten, was zusätzliche Wirkmechanismen für therapeutische Anwendungen ermöglicht.

Sogenannte „next generation“ Antikörper, wie Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) oder bispezifische Antikörper (bsAb), waren in den letzten Jahren Gegenstand intensiver Forschungsarbeit. Die Herstellung von bsAb mit einer IgG-ähnlichen Architektur stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung dar, da vier Polypeptidketten in der richtigen Weise zusammengefügt werden müssen, um einen funktionellen bsAb zu erhalten. Um das Problem der Leichtkettenpaarung zu umgehen, ist der einfachste Weg die Verwendung einer sogenannten „common light chain“ (cLC). Solche leichten Ketten können mit beiden schweren Ketten gleichermaßen assemblieren und ermöglichen eine IgG-ähnliche Architektur, ohne Einschränkung des Bindungsverhaltens.

Die erste Untersuchung im Rahmen der vorliegenden kumulativen Arbeit beschäftigte sich mit der Etablierung einer Panningmethode, basierend auf Hefe-Oberflächen-Display (YSD) und Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) im Hochdurchsatz. Um zu validieren, ob die entwickelte Technologie für die Generierung bispezifischer und biparatopischer Antikörper geeignet ist, wurde ein cLC Ansatz gewählt. Das Panning einer cLC-basierten, Hühner-Immunbibliothek gegen den Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) wurde gegen Calcein-AM gefärbte EGFR+++ A431 Zellen durchgeführt. Durch die Verwendung dieses Viabilitätsfarbstoffes wurden nur lebende Zellen im FACS analysiert, ohne dass diese Zelllinie genetisch modifiziert werden musste, wie es bei früheren Studien üblich war. Mittels FACS wurden Zell-Zell-Komplexe, bestehend aus immungefärbten Hefezellen, die ein Fab-Fragment exprimieren, gebunden an viabilitätsgefärbte Säugetierzellen, über mehrere Selektionsrunden angereichert. Es wurden Antikörper mit unterschiedlichen Sequenzen isoliert, die spezifisch A431-Zellen, nicht aber EGFR-negative Jurkat-Zellen banden. Die löslich produzieren Antikörper wiesen eine hervorragende Stabilität, Aggregation und Spezifität auf und besaßen eine bemerkenswerte Affinität. Darüber hinaus wurde mehrere unterschiedliche Epitope adressiert, darunter auch das therapeutisch interessante Epitop von Cetuximab, einem therapeutisch zugelassenen anti-EGFR Antikörper. Dies stellte die erste über ein Hefe-Panning angereicherte Immunbibliothek dar und demonstrierte darüber hinaus zum ersten Mal, dass Hühner-Antikörper mit dem cLC-Konzept kompatibel sind. Diese Ergebnisse ebneten den Weg für das Panning gegen andere Membranproteine, die nicht als lösliches Antigen produziert werden könnten, wie beispielsweise G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). Zusätzlich wurden die Methodiken zur Generierung von cLC-basierten biparatopischen und bispezifischen Antikörpern erweitert.

Die zweite Studie befasste sich mit der Generierung von biparatopischen Anti-EGFR-Antikörpern, isoliert aus einer cLC Hühner-Immunbibliothek. Zunächst wurde ein EGF-blockierender Antikörper, der die Domäne III des EGFR targetierte, identifiziert. Dieser Antikörper wurde dann als Detektionsantikörper verwendet, um die gleiche Bibliothek erneut auf EGFR-Bindung zu sortieren. Da der neu isolierte Antikörper ein orthogonales Epitop zum ersten Antikörper erkennen muss, konnte ein zweiter mAb isoliert werden, welcher die Domäne II adressierte. Durch die Verwendung der „Knob-into-Hole“ (KiH)-Technologie wurde ein bispezifischer Antikörper generiert. Neben einer verbesserten Affinität vermittelte dieser biparatopische Antikörper das Clustern von löslichem EGFR, was durch Größenausschlusschromatographie-Experimente (SEC) nachgewiesen wurde. Darüber hinaus wurde auch zellgebundenes EGFR geclustert, was sich in einer verbesserten Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) zeigte. Diese Wirkungsweise wurde durch das „Mixed-Site“-Bindungsprofil des biparatopischen Antikörpers vermittelt. Die Mixed-Site-Bindung beschreibt in diesem Zusammenhang die Fähigkeit eines biparatopischen Antikörpers, zwei verschiedene EGFR-Moleküle gleichzeitig zu binden oder die Unfähigkeit, beide Epitope auf einem einzelnen EGFR-Molekül zeitgleich binden zu können. Dies ermöglicht die zusätzliche Bindung von zwei biparatopischen mAb an ein Antigenmolekül, was zu einem Clustern des Antigens führt. Effektives Clustering von EGFR wurde in Bio-Layer-Interferometrie (BLI)- und Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)-basierten Experimenten nachgewiesen. Die Methode zur Generierung biparatopischer Antikörper durch ein Epitop-Binning-basiertes Screening könnte in Zukunft die Entdeckung therapeutischer mAbs mit biparatopischem Bindungsverhalten beschleunigen. Darüber hinaus stellt diese Studie den ersten bispezifischen Antikörper aus Hühnern sowie den ersten cLC-basierten biparatopischen Antikörper dar.

Die dritte Studie evaluierte die Verwendung einer neuen „Next Generation Sequencing“ (NGS)-basierten Methode für die Humanisierung von Hühner-abgeleiteten Einzelketten-Antikörper (scFvs) unter Verwendung von YSD und FACS. Dazu wurden die complementary determining regions (CDRs) von zwei anti-EGFR Hühner-scFvs auf sequenzähnliche menschlichen Framework-Regionen transplantiert, welche für VH bzw. VL kodierten. Zusätzlich wurden sechs Vernier-Reste in den VH- und vier in den VL-Sequenzen teilweise randomisiert, um entweder die menschlichen oder die Hühner-Keimbahn-Aminosäuren an diesen Positionen zu kodieren. Da die Vernier-Reste entscheidend für die Ausrichtung der CDRs und damit für die Antigenbindung sind, kann der humanisierte Antikörper mit der höchsten Affinität mittels FACS identifiziert werden. Die Humanisierung wurde sowohl im scFv- als auch im Fab-Format durchgeführt. Next Generation Sequencing nach zwei FACS-Sortierrunden ergab eine Anreicherung bestimmter Vernier-Kombinationen. Die humanisierten Antikörper wurden als scFv-Fc-Fusionen bzw. als Volllängen-IgG-Antikörper hergestellt. Biophysikalische Analysen zeigten eine verbesserte Stabilität und ein verbessertes Aggregationsverhalten bei nahezu gleichbleibender Affinität. Zusätzlich war die Keimbahnidentität vergleichbar mit der von therapeutisch zugelassenen humanisierten Antikörpern. Diese Technologie ermöglicht daher die schnelle und bequeme Humanisierung von Hühner-Antikörpern durch einen generischen Prozess, was Hühner-Antikörper für therapeutische Verwendungen interessant macht.

In der vierten Studie wurde der zuvor generierte EGF-blockierende mAb durch einen neuartigen Leichtketten-Shuffling-Ansatz affinitätsmaturiert. Dieser Ansatz basierte auf dem einbringen von Bindungsstörenden Mutation den CDRs der VH und der Auswahl einer neuen VL-Domäne, welche die Bindung wiederherstellen kann. Diese neue leichte Kette wurde als cLC für eine anti-CD16a- und eine anti-PD-L1-Bibliothek ausgewählt. Der resultierende CD16a-Binder band mit hoher Affinität an beide humanen CD16a-Isotypen und blockierte die Interaktion zu humanem IgG1-Fc. Der PD-L1-Binder wies ein überlappendes Epitop mit Durvalumab, einem von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen anti-PD-L1-Antikörper, auf und blockierte effektiv die Interaktion von PD-1 und PD-L1. Die drei Fab-Fragmente wurden anschließend humanisiert und in einen trispezifischen 2+1-Antikörper reformatiert, wobei eine schwere Kette den anti-EGFR-Fab-Arm trug. Die zweite Schwere Kette bestand aus dem anti-PD-L1-Fab, welcher als „Head-to-Tail“-Fusion mit dem anti-CD16a-Fab verbunden war. Das trispezifische Molekül war in der Lage, alle drei Antigene mit hoher Affinität und zudem auch gleichzeitig zu binden. Durch das gleichzeitige adressieren von EGFR und PD-L1 ermöglichte der trispezifische Antikörper einen verstärkten CD16a-vermittelten ADCC-Effekt im Vergleich zum EGFR×CD16a-bispezifischen Antikörper. Die Verwendung einer common light chain vereinfacht die Herstellung und Entwicklung von humanen 2+1 bi- und trispezifischen Antikörpern und könnte in Zukunft zur Generierung von humanen oligospezifischen therapeutischen Hühner-Antikörpern beitragen.

Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, pH-abhängiges Bindungsverhalten in die common light chain eines bispezifischen CEACAM5×CEACAM6-Antikörpers einzubauen. Dazu wurden zwei Histidine in die CDR-L1 oder in die CDR-L3 oder in beide CDRs der VL IGKV3-15 eingefügt. Eine YSD-Bibliothek wurde nach Antikörpern durchmustert, welche bei pH 7,4 an CEACAM5 binden und bei pH 6,0 nicht binden. Es wurden zwei Leichtkettenvarianten mit pH-abhängigen Bindungseigenschaften isoliert. Durch rationale Permutation der jeweiligen Histidine wurden drei neue Varianten generiert, die eine erhöhte pH-Abhängigkeit aufwiesen, wie mit BLI-Experimenten gezeigt werden konnte. Die leichte Kette, welche die stärkste pH-abhängige Bindung vermittelte, wurde darüber hinaus mit der CEACAM6-bindenden schweren Kette gepaart. Nachfolgende BLI-Experimente zeigten keine pH-Abhängigkeit, was darauf hindeutete, dass die pH-abhängige Bindung nur mit dem VH vermittelt wird, mit dem die leichte Kette ursprünglich isoliert wurde. Es wurde ein bispezifischer Antikörper generiert, der CEACAM5 pH-abhängig und CEACAM6 pH-unabhängig band. Darüber hinaus war der Antikörper in der Lage, über mehrere Zyklen hinweg pH-abhängig CEACAM5 zu binden und wieder zu dissoziieren. Diese Methodik könnte verwendet werden, um zusätzliche Wirkungsweisen in bereits existierende bi- oder multispezifische Leichtketten-Antikörper einzubauen oder um in kurzer Zeit neue pH-abhängige mAbs zu generieren.

Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit neue Methoden zur Generierung humanisierter multispezifischer Antikörper aus Hühnern entwickelt. Es wurden verschiedene Engineering-Strategien aufgezeigt, um Affinitäten zu optimieren und pH-abhängige Spezifität einzubeziehen, was den Weg für maßgeschneiderte Therapeutika ebnet.