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The Interplay of Signaling Dynamics and Cell Cycle Regulation in Single Cells

Bohn, Stefan Jürgen (2021):
The Interplay of Signaling Dynamics and Cell Cycle Regulation in Single Cells. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00019077,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: The Interplay of Signaling Dynamics and Cell Cycle Regulation in Single Cells
Language: English
Abstract:

Signaling pathways that control cellular responses such as proliferation, quiescence, migration and apoptosis are crucial for embryonic development, tissue homeostasis and regeneration. Dysregulation of these signaling processes can result in severe human diseases including cancer. Therefore, to maintain a balance between the above-mentioned cell fates and to prevent pathological events, an interplay between different signaling pathways is indispensable. For instance, mitogenic signaling induced by the mitogen-activated protein kinase (MAPK) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-AKT networks is required for cells to enter the cell cycle and divide. However, to prevent uncontrolled proliferation, anti-mitogenic signals such as those transmitted by mothers against decapentaplegic homologue (SMAD) proteins are essential. To gain a deeper understanding of these pathway interactions, I employed quantitative time-resolved measurements of fluorescent reporters and computer-aided data analysis. In the first part of the present study, I examined how the MAPK and PI3K/AKT pathways synergize to regulate cell cycle entry and progression. Although these networks have been well characterized in earlier studies, their relative contribution, especially at later cell cycle stages, remains largely unexplored. In order to investigate the response of cells outside of an active cell cycle to acute mitogenic signals, untransformed human breast epithelial cells were first arrested in a quiescent state by growth factor deprivation. Afterwards, epidermal growth factor (EGF)-induced signal processing in individual cells was quantified over time, which revealed that both pathways were necessary for initial cell cycle entry, whereas only PI3K/AKT affected the duration of S-phase at later stages of mitogenic signaling. My results provide evidence that the high metabolic demands of replication are unmet in the absence of AKT signaling, which results in a strongly prolonged S-phase of the cell cycle. In the second part, I investigated how the cell cycle and mitogenic signals influence the SMAD signaling pathway. I uncovered that ligands of the transforming growth factor beta (TGFb) superfamily signaled very differently in quiescent versus proliferating cells. While TGFb mediated a stronger SMAD2 response in proliferating cells compared to quiescent cells, the opposite was observed upon growth differentiation factor 11 (GDF11) stimulation. I was able to show that MAPK activity was responsible for the switch in ligand sensitivity, most likely through regulation of target genes. Therefore, the question arose whether a single key player or a complete pathway-rewiring were accountable. As RNA sequencing revealed considerable changes in the expression of multiple SMAD associated genes and single perturbations of SMAD signaling regulators could not explain the observed phenomenon, I hypothesized that a more wide-ranging rewiring of the network is necessary to shift the sensitivity to different ligands of the TGFb superfamily. However, further studies using genome-scale knockout or activation screenings need to be carried out to validate this idea and recreate the pathway-rewiring in proliferating cells. Besides the switch in ligand sensitivity, I observed different SMAD-mediated cell fates in proliferating and quiescent cells. While apoptosis was only induced in quiescent cells, epithelial to mesenchymal transition (EMT) and cytostasis were found in dividing cells. Interestingly, cellular responses correlated well with the dynamics of SMAD signaling, which suggested that ligands mediate diverse cellular outcomes through different dynamical patterns of SMAD2 nuclear accumulation. This quantitative nature of the pathway was later validated by real-time quantitative PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Signalwege, die zelluläre Prozesse wie Proliferation, Quieszenz, Migration und Apoptose steuern, sind entscheidend für Embryonalentwicklung, Gewebehomöostase und Regeneration. Eine Fehlregulation dieser Signalprozesse kann zu schweren Erkrankungen wie Krebs führen. Daher ist eine Wechselwirkung verschiedener Signalwege unerlässlich, um das Gleichgewicht zwischen den oben genannten Zellschicksalen aufrechtzuerhalten und pathologische Ereignisse zu verhindern. Beispielsweise sind mitogene Signale, die durch das MAPK-Netzwerk vermittelt werden, erforderlich, damit Zellen in den Zellzyklus eintreten und sich teilen können. Allerdings sind anti-mitogene Signale, wie sie von SMAD-Proteinen übertragen werden, essenziell, um unkontrollierte Zellteilung zu verhindern. In der vorliegenden Arbeit wurden quantitative zeitaufgelöste Messungen von Reporterzelllinien durchgeführt und die entstandenen Daten mittels computergestützter Analyse evaluiert, um ein besseres Verständnis dieser Wechselwirkungen zu erhalten. Im ersten Teil meiner Dissertation untersuchte ich wie die MAPK und PI3K/AKT-Signalwege zusammenarbeiten, um den Eintritt und das Fortschreiten des Zellzyklus zu regulieren. Obwohl diese Netzwerke in früheren Studien gut charakterisiert wurden, ist ihr relativer Beitrag, insbesondere in Bezug auf spätere Zellzyklusstadien, noch weitgehend unerforscht. Aus diesem Grund wurde die Reaktion quieszenter Zellen auf akute mitogene Stimuli untersucht. Hierfür wurden zunächst nicht transformierte humane Brustepithelzellen durch den Entzug von Wachstumsfaktoren in Quieszenz gebracht. Danach wurde die EGF-induzierte Signalverarbeitung in einzelnen Zellen über die Zeit quantifiziert, was zeigte, dass beide Signalwege für den Eintritt in den Zellzyklus notwendig sind, aber nur PI3K/AKT die Dauer der S-Phase beeinflusste. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass die hohen Stoffwechselanforderungen der S-Phase ohne funktionsfähiges AKT nicht erfüllt werden, wodurch es zu einer stark verlängerten Zellzyklusphase kommt. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich, wie der Zellzyklus und mitogene Signale den SMAD Signalweg beeinflussen. Dabei ergab sich, dass Liganden der TGFb-Superfamilie in ruhenden und sich teilenden Zellen sehr unterschiedliche Auswirkungen haben. Während TGFb eine stärkere SMAD2-Antwort in proliferierenden Zellen im Vergleich zu quieszenten Zellen induzierte, hatte GDF11 einen gegenteiligen Effekt. Ich konnte zeigen, dass der Grund für den Wechsel der Liganden Empfindlichkeit die MAPK-Aktivität war, welche vermutlich die Regulation der Zielgene veränderte. Daher stellte sich als nächstes die Frage, ob ein einzelnes Gen oder eine vollständige Neuverschaltung des Signalweges für diesen Effekt verantwortlich war. Da RNA-Sequenzierung deutliche Veränderungen in der Expression mehrerer SMAD-assoziierter Gene zeigte und einzelne Störungen der SMAD-Signalregulatoren das beobachtete Phänomen nicht nachbilden konnten, stellte ich die Hypothese auf, dass eine umfassendere Neuverschaltung des Netzwerks erforderlich ist, um die Empfindlichkeit gegenüber verschiedener Liganden zu verändern. Allerdings müssten weitere Studien, die beispielsweise Knockout- oder Aktivierungsscreenings im genomischen Maßstab verwenden, durchgeführt werden, um diese Hypothese zu validieren. Zusätzlich zur Änderung der Liganden-Empfindlichkeit beobachtete ich verschiedene SMAD-vermittelte Zellschicksale in proliferierenden und ruhenden Zellen. Während Apoptose nur in Zellen außerhalb eines aktiven Zellzyklus festgestellt wurde, wurden EMT und Zytostase nur in sich teilenden Zellen nachgewiesen. Die zellulären Reaktionen korrelierten sehr stark mit der Dynamik der SMAD-Signalübertragung, was darauf hindeutet, dass Liganden unterschiedliche zelluläre Auswirkungen durch Variationen in den SMAD2-Dynamiken vermitteln. Diese quantitativen Eigenschaften des Signalweges wurden später durch RT-qPCR und RNA-Sequenzierung bestätigt.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: VII, 145 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Systems Biology of the Stress Response
Date Deposited: 08 Jul 2021 07:33
Last Modified: 08 Jul 2021 07:33
DOI: 10.26083/tuprints-00019077
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-190771
Referees: Löwer, Prof. Dr. Alexander ; Nuber, Prof. Dr. Ulrike A.
Refereed: 11 June 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/19077
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