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Binding Proteins and Receptor Binding Domains as Sensor Elements for Biological and Artificial Nanopores

Bernhard, Max (2021):
Binding Proteins and Receptor Binding Domains as Sensor Elements for Biological and Artificial Nanopores. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00018587,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Binding Proteins and Receptor Binding Domains as Sensor Elements for Biological and Artificial Nanopores
Language: English
Abstract:

Miniaturized electrical biosensors have become a promising tool for monitoring and analyzing biologically relevant substances by converting a biological signal into an electric current. Despite great progress in the analysis of macromolecules, the detection of small molecules that are of particular interest for medical and environmental analytics still remains a challenge. Here, the functional connection of a sensing element to an electrical switch is a bottleneck in biosensor design. Bacterial substrate binding proteins (SBPs) and ligand gated ion channels (LGICs) evolved over billions of years to recognize a variety of biologically relevant molecules with high selectivity and sensitivity. While SBPs are involved in the uptake of substances across bacterial cell membranes, LGICs mediate neuronal excitation in the central nervous system of vertebrates. The ancient binding modules of these two protein families share a conserved clamshell-like structure and entrap the ligand in their inter-lobe cleft by inducing a large conformational transition between the open- and closed- cleft states in a venus flytrap-like mechanism. In this work, i) the underlying mechanisms of ligand recognition and functional adaptability of LGICs and SBPs are investigated and exploited to ii) couple SBPs as sensor domains to biological and solid-state nanopores to build new types of electrical biosensors for the specific detection of biologically relevant small molecules. Despite their intrinsic capability to convert a chemical signal into an electrical signal, LGICs are only now gradually being used for biosensor design since core aspects in the mechanistic understanding of ligand recognition, modulation and activation in different receptor subtypes are poorly understood. Here we investigated the structural impact and mechanism(s) of full and partial agonism in glycine receptors (GlyRs) in its native lipid environment and the modulatory role of the amino terminal domain (NTD) in GluN1/GluN3 NMDA receptor auto-inhibition after glycine binding to the low affinity GluN1 subunit. We show that the full agonist glycine and the partial agonist taurine induce different conformational transitions of the α1 GlyR. In addition, we show that the expression system dependent variability of agonist affinity in HEK293 cells and Xenopus oocytes is not mediated by an altered conformational change. Furthermore, we report that the GluN3A NTD has a major role in GluN1/GluN3A receptor regulation by reducing the efficacy of glycine-depended receptor activation by agonist-evoked auto-inhibition. This effect is possibly mediated by the subunit interface and the NTD-LBD linkers of the GluN3A NTD. These insights into the conformational changes and structural adaptability have been further exploited to use bacterial SBPs and SBDs from LGICs as a molecule detector when connected to an electrical switch by coupling the ectoine binding protein EhuB to the channel pore of the ionotropic glutamate receptor GluR0 to design receptor-based biosensor and by coupling the phosphonate binding protein PhnD inside a single track-etched solid-state nanopore that combines the high affinity and selectivity of SBPs with the robustness of artificial nanopores. These new classes of electrical biosensors are characterized by a high ligand-affinity and specificity with concentration-dependent changes in the (nanopore) current after Ligand binding. The results in this work provide an excellent foundation for the use of SBPs and LGICs as sensor domains to developme new classes of electric biosensors with high specificity and affinity for detection of biologically relevant small molecules. Moreover, our approaches and insights into ligand recognition and modulation enhance the repertoire of biophysical methods and may deepen the understanding of the functions of LGICs at the molecular, synaptic and systemic level.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Miniaturisierte elektrische Biosensoren sind zu einem vielversprechenden Werkzeug für die Überwachung und Analyse biologisch relevanter Substanzen geworden, indem sie ein biologisches Signal in einen elektrischen Strom konvertieren. Trotz großer Fortschritte bei der Analyse von Makromolekülen bleibt die Detektion von niedermolekularen Verbindungen, die für die Medizin- und Umweltanalytik von besonderem Interesse sind, eine Herausforderung. Die funktionelle Kopplung eines Sensorelements an einen elektrischen Schalter ist hierbei ein Knackpunkt im Biosensoren-Design. Bakterielle Substratbindeproteine (SBP) und Liganden-gesteuerte Ionenkanäle (LGICs) haben sich über Milliarden von Jahren entwickelt, um eine Vielzahl biologisch relevanter Moleküle mit hoher Selektivität und Sensitivität zu erkennen. Während SBP am Transport von Substanzen durch bakterielle Zellmembranen beteiligt sind, vermitteln LGICs die neuronale Erregung im zentralen Nervensystem von Wirbeltieren. Die archaischen Bindungsmodule beider Proteinfamilien teilen eine konservierte muschelartige Struktur; der Ligand wird zwischen den zwei Subdomänen gebunden und löst einen großen Konformationsübergang zwischen dem offenen und geschlossenen Zustand in einem Venusfliegenfallen-ähnlichen Mechanismus aus. In dieser Arbeit werden i) die zugrundeliegenden Mechanismen der Ligandenerkennung und die funktionelle Anpassungsfähigkeit von LGICs und SBPs untersucht und ausgenutzt um ii) SBP an biologische und artifizielle Nanoporen zu koppeln mit dem Ziel neuartige elektrische Biosensoren für den spezifischen Nachweis von biologisch relevanten Substanzen zu entwickeln. Trotz ihrer intrinsischen Fähigkeit ein chemisches Signal in ein elektrisches Signal umzuwandeln, werden LGICs erst allmählich für das Design von Biosensoren genutzt, da Schlüsselaspekte im mechanistischen Verständnis der Ligandenbindung, -modulation und Rezeptoraktivierung in verschiedenen Rezeptorsubtypen unzureichend verstanden sind. In dieser Arbeit untersuchten wir die strukturellen Auswirkungen und die zugrundeliegenden Aktivierungsmechanismen von vollen und partiellen Agonisten in Glycinrezeptoren (GlyRs) in ihrer nativen Lipidumgebung, sowie die Funktion der aminoterminalen Domäne (NTD) in der GluN1/GluN3 NMDA-Rezeptor Autoinhibition nach Glycinbindung an die GluN1-Untereinheit. Wir können zeigen, dass der volle Agonist Glycin und der partielle Agonist Taurin unterschiedliche Konformationsübergänge im α1 GlyR induzieren. Darüber hinaus legen wir dar, dass die vom Expressionssystem abhängige Variabilität der Agonistenaffinität in HEK293-Zellen und Xenopus Oozyten nicht durch eine veränderte Konformationsänderung vermittelt wird. Des Weiteren zeigen wir, dass die GluN3A-NTD eine wichtige Rolle in der Regulation von GluN1/GluN3A NMDA-Rezeptor Subtypen spielt, indem sie die Wirksamkeit der Glycin-abhängigen Rezeptoraktivierung durch Agonisten-ausgelöste Autoinhibition reduziert. Dieser Effekt wird möglicherweise durch das Subunit-Interface und den NTD-LBD-Linker der GluN3A-NTD vermittelt. Die vertieften Erkenntnisse über die Konformationsänderungen und die strukturelle Anpassungsfähigkeit dieser Bindedomänen wurden weiter genutzt, um bakterielle SBP und LGIC SBD in Kombination mit einem elektrischen Schalter als Moleküldetektor zu verwenden. Hierfür wurde das Ectoin-Bindeprotein EhuB an die Kanalpore des ionotropen Glutamatrezeptors GluR0 gekoppelt, um einen rezeptorbasierten Biosensor zu konstruieren, sowie das Phosphonatbindeprotein PhnD innerhalb von einzelnen Festkörper-Nanoporen gekoppelt, mit dem Ziel die hohe Affinität und Selektivität von SBPs mit der Robustheit von künstlichen Nanoporen zu kombinieren. Diese neuen Biosensor-Klassen zeichnen sich durch eine hohe Ligandenaffinität und Spezifität, als auch durch eine konzentrationsabhängige Änderung des (Nanoporen-)Stroms nach Ligandenbindung aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit bieten eine profunde Grundlage um SBP und LGIC als Sensordomänen für die Entwicklung neuartiger elektrischer Biosensoren mit hoher Spezifität und Affinität für den Nachweis biologisch relevanter Moleküle zu nutzen. Darüber hinaus erweitern die hier gezeigten Ansätze und Erkenntnisse zur Ligandenerkennung und -Rezeptormodulation das Repertoire biophysikalischer Methoden und könnte das Verständnis der Funktionen von LGIC auf molekularer, synaptischer und systemischer Ebene vertiefen.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 90 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Neurophysiology and Neurosensory Systems
Date Deposited: 28 Jun 2021 08:58
Last Modified: 28 Jun 2021 08:58
DOI: 10.26083/tuprints-00018587
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-185875
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard ; Laube, Prof. Dr. Bodo
Refereed: 6 May 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/18587
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