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Die Rolle der kleinen RNA scr5239 in Streptomyces coelicolor

Engel, Franziska Marianne (2021):
Die Rolle der kleinen RNA scr5239 in Streptomyces coelicolor. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00017527,
[Ph.D. Thesis]

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Dissertation Franziska Marianne Engel.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Die Rolle der kleinen RNA scr5239 in Streptomyces coelicolor
Language: German
Abstract:

Streptomyces coelicolor ist ein Modellorganismus für die GC-reichen, Gram-positiven Actinobakterien. Der Stamm gehört zu den am besten untersuchten Vertretern der Gattung der Streptomyceten. S. coelicolor hat einen sehr komplexen Lebenszyklus und muss sich als Bodenbakterium ständig an sich ändernde Umweltbedingungen anpassen. Diese Tatsache spiegelt sich unter anderem darin wieder, dass ca. 1000 der etwa 8000 annotierten Genen eine regulatorische Funktion zugeschrieben wurde. Unter diesen befinden sich 64 Sigma-Faktoren. Dazu gehören der Masterregulator PhoP, welcher die Phosphataufnahme steuert, GlnR, der den Stickstoffmetabolismus koordiniert und DasR, welcher als zentraler Regulator des Kohlenstoffmetabolismus gilt und die Verstoffwechselung der hauptsächlich in der natürlichen Umgebung vorkommenden Kohlenstoffquelle Chitin mit verschiedensten Prozessen in der Zelle verbindet. Im Gegensatz zur transkriptionellen Regulation ist die Regulation auf posttranskriptioneller Ebene in Streptomyceten bislang wenig untersucht. Die Rfam-Datenbank listet eine Vorhersage mit etwa 20 bekannten cis-regulatorischen Elementen auf. Zusätzlich dazu werden in Streptomyceten, wie auch in vielen anderen Organismen, immer mehr regulatorische RNAs identifiziert, deren genaue Funktion jedoch oft noch ungeklärt ist. Zu diesen gehören kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs – small non coding RNAs), welche eine wichtige Rolle bei der posttranskriptionellen Regulation spielen. Sie sind typischerweise 50-200 nt lang, strukturell sehr divers und zeigen eine große Varianz in ihrer Wirkungsweise und der Zielgene, die sie regulieren. Als Regulatoren der Translation binden sie in vielen Fällen komplementär den Bereich der Ribosomenbindestelle ihrer Ziel-mRNA, maskieren diesen und inhibieren so die Initiation der Translation. Die am besten untersuchete sRNA in Streptomyceten ist scr5239 in S. coelicolor. Sie ist upstream von ORF5239 kodiert, 159 nt lang und in etwa 2/3 aller bekannten Streptomycetengenome sowohl strukturell als auch in großen Teilen in ihrer Sequenz hoch konserviert. Zu Beginn dieser Arbeit waren bereits zwei Zielegene von scr5239 charakterisiert: dagA und metE, welche für eine Agarase und eine Methionin-Synthase kodieren. Ausgehend von einer Proteom-Analyse konnten in dieser Arbeit drei weitere Ziele für scr5239 identifiziert werden: pepck, mor und thiL welche für die Phosphoenolpyruvatkinase, die Malat-Oxidorduktase und die Acetyl-CoA-Acetyltransferase kodieren. Western-Blot- und RT-qPCR-Analysen zeigten, dass die sRNA die Expression dieser Ziele auf der posttranskriptionellen Ebene reprimiert. PEPCK, MOR und ThiL sind eng mit dem zentralen Stoffwechsel verbunden. PEPCK ist ein Schlüsselenzym des Primärmetabolismus, welches die Glykolyse mit dem Zitratzyklus verbindet, indem es die Umwandlung von Oxalacetat zu Phosphoenolpyruvat (PEP) katalysiert. MOR katalysiert die enzymatische Reaktion von Malat zu Pyruvat und ist essentiell in mehreren Teilen des Stoffwechsels, insbesondere im Zitratzyklus. ThiL katalysiert die Acetylierung von Acetyl-Coenzym A und deren Umkehrreaktion. Diese Reaktionen sind zum Auf- und Abbau von Ketonkörpern notwendig und sind somit ebenfalls eng mit dem Zitratzyklus verknüpft. Es konnte gezeigt werden, dass scr5239 durch die Regulation von pepck auch die intrazellulären PEP-Mengen beeinflusst. PEP spielt eine entscheidende Rolle in der Glykolyse und Glykoneogenese und ist damit ein Schlüssel-Intermediat des Kohlenstoffmetabolismus. Das Phosphotransferasesystem (PTS) von S. coelicolor nutzt PEP außerdem als Energiequelle für die Aufnahme und Phosphorylierung von N-Acetylglucosamin, dem Monomer von Chitin. Da die Expression des scr5239-Gens von DasR,dem Regulator des Kohlenstoffmetabolismus, welcher die Gene des PTS reguliert, abbhänging ist, lässt sich für scr5239 und DasR eine feedback-Regulation im zentralen Stoffwechsel beschreiben. Durch die katalytischen Funktionen der neu identifizierten Ziele und die feeback-Regulation von DasR konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass scr5239 eine zentrale Rolle im Stoffwechsel von S. coelicolor einnimmt.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Streptomyces coelicolor is a model organism for the GC-rich, Gram-positive actinobacteria. The strain is one of the best studied representatives of the genus Streptomyces. S. coelicolor has a very complex life cycle and, as a soil bacterium, must constantly adapt to changing environmental conditions. This is reflected, among other things, in the fact that about 1000 of the approximately 8000 annotated genes have been attributed a regulatory function. Among these are 64 sigma factors. These include the master regulator PhoP, which controls phosphate uptake, GlnR, which coordinates nitrogen metabolism, and DasR, which is considered as the central regulator of carbon metabolism and combines the metabolism of the carbon source chitin, which occurs mainly in the natural environment, with various processes in the cell. In contrast to transcriptional regulation, regulation at the post-transcriptional level in streptomyces has been studied little to date. The Rfam database lists a prediction with about 20 known cis-regulatory elements. In addition, as in many other organisms, more and more regulatory RNAs are being dentified in streptomycetes, but their exact function often remains unknown. These include small non-coding RNAs (sRNAs), which play an important role in posttranscriptional regulation. They are typically 50-200 nt long, structurally very diverse and show a large variance in their mode of action and target genes. As regulators of translation, they bind in many cases complementarily to the ribosome binding site of their target mRNAs, mask it and thus inhibit the initiation of translation. The best studied sRNA in Streptomyces is scr5239 in S. coelicolor. It is encoded upstream of ORF5239, 159 nt long and highly conserved in about 2/3 of all known streptomycete genomes, both structurally and in large parts of its sequence. At the beginning of this work two targets for scr5239 were already characterized: the genes for the agarase DagA and the methionine synthase MetE. Based on a proteome analysis, three additional targets for scr5239 were identified in this work. The genes coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase PEPCK, the malate oxidoreductase MOR and the acetyl-CoA acetyltransferase ThiL. Western blot and RT-qPCR analyses showed that the sRNA represses the expression of these targets at the post-transcriptional level. PEPCK, MOR and ThiL are closely associated with the central metabolism. PEPCK is a key enzyme of the primary metabolism that links glycolysis to the tricarboxylic acid cycle by catalyzing the conversion of oxaloacetate to phosphoenolpyruvate (PEP). MOR is the enzyme that catalyzes the reaction from malate to pyruvate. MOR is essential in several parts of the metabolism, especially in the tricarboxylic acid cycle. ThiL catalyzes the acetylation of acetyl coenzyme A and its reverse reaction. These reactions are necessary for the formation and degradation of ketone bodies and are therefore also closely linked to the tricarboxylic acid cycle. Using proteinbiochemical methods it could be shown that scr5239 also influences intracellular PEP levels by regulating pepck. PEP plays a crucial role in glycolysis and glyconeogenesis and is therefore a key intermediate in carbon metabolism. The phosphotransferase system (PTS) of S. coelicolor also uses PEP as an energy source for the uptake and phosphorylation of N-acetylglucosamine, the monomer of chitin. Since the expression of the scr5239-gene is dependent on DasR, the central regulator of the carbon metabolism, which in turn regulates the genes of PTS, a feedback regulation in the central metabolism can be described for scr5239 and DasR. Taking the catalytic functions of the newly identified targets and the feeback regulation of DasR into account, this work showed that scr5239 plays a central role in the metabolism of S. coelicolor.

English
Place of Publication: Darmstadt
Collation: V, 110 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 23 Mar 2021 08:23
Last Modified: 23 Mar 2021 08:23
DOI: 10.26083/tuprints-00017527
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-175278
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Refereed: 10 December 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/17527
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