Im Jahr 1975 konnten die Wissenschaftler Köhler und Milstein erfolgreich B-Lymphozyten aus immunisierten Mäusen mit Myelomzellen fusionieren und mittels dieses, als Hybridoma Technologie bezeichneten Verfahrens, Zellen erzeugen die Vorteile beider Vorgängerzellen vereinten. Diese immortalisierten Hybridomazellen sind sowohl kultivierbar, als auch in der Lage Antigen spezifische Antikörper zu sezernieren. Ihre bahnbrechende Erfindung für die Herstellung von Antikörpern wurde 1984 mit dem Nobelpreis honoriert. Allerdings stellt die Hybridoma Technologie einen langwierigen Prozess mit geringer Effizienz dar. Zusätzlich ergibt sich durch die murine Herkunft der Antikörper eine potenzielle Immungenitätsproblematik bei Applikation im Menschen. Aus diesen Gründen wurden in den letzten Jahrzehnten verschiedene Technologien zur Überwindung dieser Limitationen entwickelt. Sie umfassen dabei die Nutzung von humanen naiven, semi- oder komplett synthetischen Antikörperdiversitäten (zur Vermeidung der Immungenitätsproblematik) in Verbindung mit zellulären oder nicht-zellulären in vitro Selektionssystemen zur Präsentation und Isolation von Antikörpern, wie z.B. das Phagen- oder Hefe-Display. Durch die Entwicklung dieser Methoden konnten große Repertoires bezüglich vorgegebener Eigenschaften durchmustert und spezifische Moleküle isoliert werden, was den heutigen, erfolgreichen Einsatz von monoklonalen Antikörpern in biotechnologischen und medizinischen Anwendungen unterstützte. Trotz aller Verbesserungen im Antikörperfindungsprozess stellt die Generierung der initialen Display-Bibliotheken immer noch einen aufwendigen und anspruchsvollen Prozess dar. Dieser ist oft mehrstufig und umfasst am Beispiel des Hefe-Displays verschiedene Klonierungsschritte, die Erstellung von getrennten Bibliotheken für schwere und leichte Ketten, sowie letztlich deren Paarung durch Mating. Dieser Ablauf kann durch die Anwendung von Golden Gate Cloning (GGC) vereinfacht werden und in nur einer Reaktion erfolgen. Die Klonierungsreaktion im GGC beruht dabei auf der Nutzung von Typ IIs Restriktionsenzymen. Diese Enzyme schneiden DNA in einer definierten Distanz außerhalb ihrer Erkennungssequenzen und ermöglichen dadurch die Inkorporation von Überhängen mit gewünschter Signatur. Typ IIs Restriktionsenzyme erlauben somit einen gerichteten, einstufigen Klonierungsprozess, bei dem die Erkennungssequenzen während der Reaktion entfernt und das Reaktionsgleichgewicht auf die Seite des spezifischen Klonierungsproduktes verschoben wird. In der vorliegenden Arbeit konnte anhand von drei unterschiedlichen Selektionskampagnen die Anwendbarkeit von GGC für die Bibliotheks-Generierung im Hefen- und Phagen-Display demonstriert werden. Dabei wurden spezifische Fab Antikörper gegen CEACAM6, EGFR und hCG aus Immunrepertoiren von transgenen Ratten und Wildtyp Hühnern (Hefe-Display), sowie EGFR spezifische scFv und VHH Antikörper aus Immunrepertoiren von Hühnern und Kameliden (Phagen-Display) isoliert. GGC konnte dabei im Vergleich zur klassischen Generierung von Antikörper-Bibliotheken bezüglich Verteilungen der Genrepertoires, der allgemeinen Bibliotheks-Größen, sowie biophysikalischer Charakteristika der isolierten Antikörper validiert werden. Der entwickelte, einstufige GGC Prozess ist in der Lage Antikörper Bibliotheken basierend auf kombinatorischen schweren und leichten Ketten Diversitäten mit gleicher Qualität gegenüber der traditionellen Methode zu generieren. Zusätzlich bietet er den Vorteil einer schnelleren und weniger aufwendigen Methodik, da er die multiplen Schritte des traditionellen Ansatzes parallelisiert. Neben klassischen monoklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten bieten neue Antikörperformate Ansätze zur therapeutischen Anwendung. Dazu zählen Moleküle wie bispezifische Antikörper (bsAbs) und Immunoliganden, sowie andere Antikörperfragmente und -derivate, z.B. kamelide Einzeldomänenantikörper Fc Fusionen. Bei der Herstellung von IgG-basierten bispezifischen Antikörpern, bestehend aus zwei unterschiedlichen schweren und zwei unterschiedlichen leichten Ketten, müssen theoretisch vier unterschiedlichen Plasmide für deren Expression in der Zellkultur eingesetzt werden, was zu einer statistischen Ausbeute von lediglich 12.5 % des gewünscht assembliertem Proteins führt. Eine Möglichkeit die Heterogenität bei der Expression von mehreren gleichgearteten Polypeptidketten zu umgehen, ist die Nutzung der Strand-Exchange Engineered Domain (SEED) Technologie. Durch die Einfügung alternierender IgA und IgG β Faltblatt Strukturen in den CH3 Domänen, entstehen anti-parallele Immunglobulinstrukturen, die eine Heterodimerisierung der schweren Ketten begünstigen. Zur Vermeidung von Homodimerisierung der schweren Ketten wurden neben SEED noch andere Technologien wie „knob-into-holes“, controlled Fab arm exchange oder gezielte Aminosäure-Austausche zur Einführung von konträren elektrostatischen Ladungen in den beiden schweren Ketten entwickelt. Um darüber hinaus eine leichte Ketten-Fehlpaarung der Antikörper zu verhindern, wurden ebenfalls diverse Technologien entwickelt, wie z.B. CrossMab oder die Nutzung einer Common Light Chain. Eine weitere Möglichkeit hierfür besteht zusätzlich in der Verwendung von kameliden VHH Domänen. Diese nutzen nicht die für den kanonischen Antikörper notwendige leichte Kette, sondern stellen eine spezifische Antigen-Bindung ausschließlich über die variable Domäne der schweren Kette her. In diesem Kontext war ein Ziel der vorliegenden Arbeit die Kombination der SEED Technologie mit einem 2013 von Baty und Kollegen konzeptionell beschriebenen Fab ähnlichen bispezifischen VHH Antikörper. Dies ermöglichte die Generierung einer neuartigen bi- und trispezifischen, IgG-ähnlichen VHH basierten Antikörperplattform mit damit verbundenen variablen Valenzen im Rahmen dieser Promotion. Die Ergebnisse der Charakterisierung dieses Antikörperformats bezüglich ihrer biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften, wie z.B. spezifischem, NK-Zell vermitteltem ADCC, belegten die Vielseitigkeit dieser generischen Plattform zur Expression voll funktioneller mono-, bi und trispezifischer Antikörper mit unterschiedlichen Valenzen als „plug-and-play“ Anwendung. Darüber hinaus ist der Einsatz von bispezifischen Molekülen für die gerichtete NK-Zell Rekrutierung in heutiger Zeit von großem Interesse. Die spezifische NK-Zell Rekrutierung zu tumorösen oder infizierten Zellen ermöglicht eine spezifische Zytolyse der Zielzellen und die gleichzeitige Immunmodulation durch eine NK-Zell vermittelte Zytokin-Freisetzung. Eine Möglichkeit, um die Rekrutierung von NK-Zellen zu adressieren, bieten die von diesen Zellen umfassend exprimierten Natürlichen Cytotoxischen Rezeptoren (NCRs). In dieser Arbeit konnte mittels Hefe-Display die bindungsrelevante N-terminale IgV-ähnliche Domäne des natürliche Liganden B7 H6 für den NCR Rezeptor NKp30 affinitätsmaturiert werden. Mittels Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) basierter Selektion wurden B7 H6 Varianten mit signifikant erhöhter Affinität zu NKp30 erhalten. Auch zeigten diese Varianten bei der Anwendung im Format bispezifischer Immunoliganden signifikant gesteigerte NK-Zell vermittelte Zytotoxizitäten und Zytokin-Freisetzungen gegenüber dem parentalen B7 H6 Molekül. Diese Erkenntnisse belegen die zu Grunde liegende Hypothese, dass eine gesteigerte Affinität von B7 H6 zu NKp30 in einer erhöhten NK-Zell basierten Tumorzell-Zytolyse und einer gesteigerten NK-Zell vermittelten Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen resultiert. Eine Affinitätssteigerung von natürlichen Liganden aktivierender NK-Rezeptoren könnte somit zur Entwicklung potenzieller Immuntherapeutika zur Behandlung von Patienten mit unterschiedlichen Krebserkrankungen verwendet werden.