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Entwicklung zellbasierter Assays für die Evaluation von Chemokininhibitoren

Engemann, Victoria (2021):
Entwicklung zellbasierter Assays für die Evaluation von Chemokininhibitoren. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt,
DOI: 10.26083/tuprints-00017372,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Entwicklung zellbasierter Assays für die Evaluation von Chemokininhibitoren
Language: German
Abstract:

Chemokine (chemotaktische Cytokine) sind eine Klasse kleiner Signalproteine, die an verschiedenen Prozessen der Immunantwort beteiligt sind und eine angiogenetische oder angiostatische Wirkung haben können. Chemokine bilden im Organismus lösliche und immobilisierte Gradienten aus, anhand derer sich Immun- und Stammzellen orientieren können. Diese Zellen wandern entlang dieser Gradienten, wobei man im Fall der löslichen Gradienten von Chemotaxis und im Fall der immobilisierten Gradienten von Haptotaxis spricht. Die Überexpression oder fehlerhafte Regulation von Chemokinen führen zu verschiedenen Krankheiten. Dazu gehören verschiedene Autoimmunerkrankungen wie z.B. rheumatoide Arthritis oder Psoriasis und Krankheiten, bei denen eine übermäßige Rekrutierung von Immunzellen stattfindet, wie z.B. Arteriosklerose und Asthma. Aber auch bei der Metastasenbildung verschiedener Krebsarten und der Blutversorgung von Tumoren sind Chemokine beteiligt. Um genauere Einblicke in das Zusammenspiel löslicher und immobilisierter Gradienten verschiedener synergistisch und antagonistisch wirkender Chemokine zu erhalten, werden Systeme benötigt, mit denen Zellantworten auf einzelne oder mehrere Chemokine untersucht werden können. Um Chemokine, ihre Wirkung auf Zellen des Immunsystems und ihre Inhibition untersuchen zu können, werden große Mengen der entsprechenden Chemokine benötigt. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit eine entsprechende Reinigungsstrategie entwickelt werden. Da Chemokine ihre Rezeptoren über ihren N-Terminus aktivieren, ist es von großer Bedeutung, dass die gereinigten Chemokine über einen nativen N-Terminus verfügen. Es wurden daher drei verschiedenen Expressions- und Reinigungsstrategien mit und ohne His6-Tag getestet. Für die Evaluierung potentieller Chemokininhibitoren wird ein einfach durchzuführender plattenbasierter Assay benötigt, mit dem mehrere Proben gleichzeitig untersucht werden können. Da bei der Inhibition der Chemokine zur Modulation der Zellantwort von Leukozyten wichtig ist, dass der letzte Schritt der Signalkaskade, die Chemotaxis, inhibiert wird, sollte dieser Assay entweder die Chemotaxis selbst oder einen chemotaxisnahen Schritt in der Signalkaskade adressieren. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit ein in einer vorangegangenen Dissertation vorgestellter Assay weiterentwickelt werden, der die Aktinpolymerisation misst, die ein Bestandteil des molekularen Mechanismus der Chemotaxis ist. Im dritten Teil der Arbeit sollte ein mikrofluidisches System etabliert werden, mit dem das Zusammenspiel löslicher und immobilisierter Chemokingradienten untersucht werden kann. Zunächst wurde der Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit auf den Verlauf des Gradienten untersucht. Anschließend wurden die Gradienten im Kanal immobilisiert. Um eine Immobilisierung der IL-8-Konzentrationsprofile im Kanal zu erreichen, wurde der Kanal mit Heparin beschichtet, um die natürliche Präsentation der Chemokine auf der Zelloberfläche nachzuahmen. Dabei wurde das Heparin mithilfe von Dopamin unter oxidativen Bedingungen kovalent an den Kanal gebunden. Anschließend wurden mit den immobilisierten Gradienten Zellmigrationsversuche durchgeführt, die eine signifikante Migration der Zellen auf den immobilisierten Gradienten zeigten.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Chemokines (chemotactic cytokines) are a class of small signaling proteins that are part of various processes of the immune response and have angiogenetic or angiostatic effects. In organisms, chemokines form soluble and immobilised gradients which are used by immune and stem cells for orientation. The cell migration along these gradients is termed chemotaxis in case of soluble gradients and haptotaxis in case of immobilised gradients. The overexpression or incorrect regulation of chemokines can lead to various diseases like autoimmune diseases, e.g. rheumatoid arthritis or psoriasis, and diseases which are related to an excessive recruitment of immune cells, e.g. arteriosclerosis and asthma. Additionally, chemokines are involved in the metastasis of cancer and the blood supply of tumors. To get a better insight in the cooperation of soluble and immobilised gradients of different synergistic and antagonistic chemokines, systems for the examination of the cell response to one ore more chemokines are necessary. To examine chemokines and their effects on cells of the immune system and their inhibition a great amount of chemokines is needed. Therefore, a strategy for the purification of the respective chemokines should be established in this work. Since chemokines activate their receptors via their N-terminus it is very important that chemokines exhibit a native N-terminus. For this reason, three different expression and purifications strategies with and without His6-tag were tested. For the evaluation of potential chemokine inhibitors a simple plate based assay is needed, with which a high number of samples could be examined simultaneously. For the inhibiton of the leukocyte cell movement the last step of the signaling cascade, chemotaxis, has to be inhibited. Therefore, a suitable assay should adress chemotaxis itself or a step close to chemotaxis. In this work, an assay presented in a previous work that measures actin polymerisation should be further developed. In the third part of this work a microfluidic system for the examination of the coorporation of soluble and immobilised chemokine gradients should be established. At first the influence of the flow velocity on the formation of the gradient was studied. Afterwards, the gradients were immobilised in the channel using a heparin layer that mimics the natural presentation of chemokines on cell surfaces. The heparin was covalently bound to the channel via a dopamine layer under oxidative conditions. The cell migrations experiments carried out with these immobilised gradients showed significant migration of the cells on the immobilised gradients.

English
Place of Publication: Darmstadt
Collation: xi, 118 Seiten, XIX
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Biologische Chemie
Date Deposited: 03 Feb 2021 07:15
Last Modified: 03 Feb 2021 07:16
DOI: 10.26083/tuprints-00017372
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-173725
Referees: Schmitz, Prof. Dr. Katja and Kolmar, Prof. Dr. Harald
Refereed: 14 December 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/17372
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