TU Darmstadt / ULB / TUprints

Functional characterization of a new IgM- and IgA-enriched immunoglobulin preparation

Schmidt, Carolin (2020):
Functional characterization of a new IgM- and IgA-enriched immunoglobulin preparation. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00015398,
[Ph.D. Thesis]

[img]
Preview
Text (PDF/A)
Doktorarbeit Carolin Schmidt.pdf
Available under CC-BY-SA 4.0 International - Creative Commons, Attribution Share-alike.

Download (4MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Functional characterization of a new IgM- and IgA-enriched immunoglobulin preparation
Language: English
Abstract:

The development and the functional characterization of human plasma-derived immunoglobulin (Ig) preparations are of high clinical relevance for the therapy of patients who suffer from antibody depletion, autoimmune or inflammatory disorders. Currently, mainly intravenous immunoglobulin G (IgG) preparations (IVIgs) are in use to treat a broad range of pathological conditions, like primary and secondary immunodeficiencies (PID; SID), but also for immunomodulation. Nevertheless, there is a need to improve the exploitation of the plasma as well as the efficacy of polyclonal Ig preparations without an increase in plasma demand. Especially fractions containing IgA and IgM molecules may be advantageous, because of their versatile pharmacological effects that could be exploited therapeutically. Trimodulin (name of the active substance, for differentiation from a standard IVIg preparation) is a new plasma-derived Ig preparation for intravenous application and is unique, as it contains besides IgG also defined amounts of IgM as well as IgA molecules compared to currently available standard IVIg preparations. It was developed for the treatment of patients with severe infections and was already tested in a phase II clinical trial (CIGMA study), where a promising potential in the therapy of patients with severe community-acquired pneumonia (sCAP) could be demonstrated. Based on the novelty and complexity of this Ig preparation that contains besides IgG also IgM as well as IgA molecules, there is still a need for a detailed understanding of the complex mode of action (MoA) of trimodulin regarding its antimicrobial as well as its immunomodulatory mechanisms. Particularly the complement system is an important tool of the humoral immune system, because its activation leads to the killing of invading pathogens via various effector functions. Nevertheless, it can also be harmful to the host when the immune system is over-activated and can lead to tissue damage as well as multiple organ failure. Therefore, it is important that the complement system is balanced between activation and inhibition. It was hypothesized that trimodulin exhibits an ambivalent effect regarding complement activation to ensure the neutralization of invading microorganisms but also to protect the host against inflammation caused by a hyper-activated immune system. In order to evaluate the ability to inhibit complement activation, the binding of trimodulin to activated complement factors (C3b, C4b, C5a and C3a) was analyzed in ELISA settings. It was demonstrated that trimodulin is able to interact with C3b as well as C4b molecules by binding and an overlay of these complement factors. The addition of an IVIg control (Intratect) showed only slight effects and the decrease in the detection of C3b as well as C4b was obviously stronger with the IgM- and IgA-enriched preparation. Moreover, a trend in reducing the detection of C5a with trimodulin was revealed, whereas no interaction of trimodulin with activated C3a molecules could be demonstrated. Furthermore, a complement-dependent cytotoxicity (CDC) assay was used to analyze if trimodulin can even functionally prevent complement activation. Therefore, the CDC of target cells (Ramos cell line) was measured after addition of trimodulin and an obvious reduction in the CDC of Ramos cells was detected. This demonstrated for the first time that trimodulin is able to inhibit activated complement factors, which could be used to prevent inflammation in patients with an over-stimulated immune response. Furthermore, the results clearly showed the benefit of using trimodulin to prevent the over-stimulation of the complement system, over a standard IVIg preparation that was not able to reduce the CDC in this assay. In order to analyze if trimodulin, which contains besides IgG and IgA also ⋲ 23% IgM, is able to activate the complement system and to induce the opsonophagocytosis of pathogens, two opsonophagocytosis assays (OPAs) were developed. In general, IgM molecules are able to activate the complement system via the classical pathway more effectively than IgG molecules. The OPA using living E. coli bacteria unfortunately did not depict the opsonophagocytic capacity of trimodulin, but showed only the IgG-mediated phagocytosis of the bacteria. This was assumed to be due to a high non-specific killing of the used complement source, which destroyed high amounts of E. coli bacteria even in the absence of trimodulin. For this reason, a second OPA was established by using S. aureus bioparticles and the opsonophagocytic capacity of trimodulin was evaluated in a fluorescence-activated cell sorter (FACS). The analysis showed that trimodulin was able to activate the complement system concentration-dependently and thereby to trigger the opsonophagocytosis of S. aureus bioparticles by effector cells (HL-60 cell line) in low concentrations. Additionally, it was detected that even in the OPA setting trimodulin was able to inhibit the complement system in high doses. The results of this PhD thesis obviously support the theory that trimodulin exhibits an ambivalent effect regarding complement activity and are in accordance with various studies that also show dual mechanisms of Ig preparations in activating and inhibiting the complement system. Moreover, it is assumed that the treatment with trimodulin could help to reduce inflammation caused by an over-stimulation of the complement system and simultaneously ensuring the neutralization of harmful pathogens. Furthermore, the PhD thesis gives new insights in the MoA by confirmation of the complement activating as well as inhibitory capacity of trimodulin and emphasizes the crucial advantages of using an IgM- and IgA-enriched preparation compared to a standard IVIg preparation.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die Entwicklung und die funktionelle Charakterisierung von Immunglobulin (Ig) Präparaten, die aus menschlichem Blutplasma gewonnen werden, sind von hoher klinischer Relevanz für die Therapie von Patienten, die an Antikörpermangel, Autoimmun- oder an Entzündungserkrankungen leiden. Gegenwärtig werden hauptsächlich intravenös verabreichte Immunglobulin G (IgG) Präparate (IVIgs) zur Behandlung eines breiten Spektrums pathologischer Zustände, wie primärer und sekundärer Immundefekte (PID; SID), aber auch zur Immunmodulation eingesetzt. Dennoch besteht die Notwendigkeit, eine effizientere Ausnutzung des Plasmas zu erreichen sowie die Wirksamkeit polyklonaler Ig-Präparate zu verbessern, ohne den Plasmabedarf zu erhöhen. Insbesondere Fraktionen, die IgA- und IgM-Moleküle enthalten, können aufgrund ihrer vielseitigen pharmakologischen Effekte vorteilhaft sein und therapeutisch genutzt werden. Trimodulin (Wirkstoffname, welcher der Abgrenzung zu einem Standard-IVIg-Präparat dient) ist ein neues Ig-Präparat aus menschlichem Blutplasma, für die intravenöse Anwendung und ist in seiner Zusammensetzung einzigartig, da es im Vergleich zu den bisher auf dem Markt verfügbaren Standard-IVIg-Präparaten neben IgG auch definierte Mengen an IgM- sowie IgA-Molekülen enthält. Es wurde für die Behandlung von Patienten mit schweren Infektionen entwickelt und bereits in einer klinischen Phase II Studie (CIGMA Studie) getestet, in der ein vielversprechendes Potenzial für die Therapie von Patienten mit schwerer ambulant erworbener Lungenentzündung (sCAP) nachgewiesen werden konnte. Aufgrund der Neuheit und der Komplexität des Ig Präparates, das neben IgG auch IgM und IgA Moleküle enthält, besteht jedoch Bedarf an einem detaillierteren Verständnis der komplexen Wirkungsweise von Trimodulin, sowohl hinsichtlich seiner antimikrobiellen als auch seiner immunmodulatorischen Eigenschaften. Insbesondere das Komplementsystem ist ein wichtiges Werkzeug des humoralen Immunsystems, da seine Aktivierung über verschiedene Effektorfunktionen zur Abtötung eindringender Krankheitserreger führt. Es kann allerdings auch schädlich für den Wirt sein, wenn das Immunsystem überaktiviert ist und zu Gewebeschäden sowie zu multiplem Organversagen führen. Daher ist es wichtig, dass die Aktivierung sowie die Hemmung des Komplementsystems ausbalanciert sind. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass Trimodulin eine ambivalente Wirkung hinsichtlich der Komplementaktivierung aufweist, um die Neutralisierung eindringender Mikroorganismen zu gewährleisten, aber auch um den Wirt vor Entzündungsreaktionen zu schützen, die durch ein überaktiviertes Immunsystem verursacht werden können. Um zu überprüfen, ob die Aktivierung des Komplementsystems gehemmt werden kann, wurde die Bindung von Trimodulin an aktivierte Komplementfaktoren (C3b, C4b, C5a und C3a) in ELISA Tests untersucht. Es wurde gezeigt, dass Trimodulin sowohl mit C3b- als auch mit C4b-Molekülen interagieren kann, indem es diese bindet sowie überlagert. Die Zugabe einer IVIg-Kontrolle (Intratect) zeigte nur geringe Effekte und die Abnahme der C3b sowie C4b Detektion war nach Gabe des IgM- und IgA-angereicherten Präparats deutlich erhöht. Darüber hinaus zeigte sich ein Trend zur Verringerung der C5a Detektion nach Trimodulin Gabe, wohingegen keine Interaktion von Trimodulin mit aktivierten C3a-Molekülen nachgewiesen werden konnte. Des Weiteren wurde mit Hilfe eines komplementabhängigen Zytotoxizitätstests (CDC) untersucht, ob Trimodulin die Aktivierung des Komplementsystems auch funktionell verhindern kann. Daher wurde die komplementabhängige Zytotoxizität von Zielzellen (Ramos-Zelllinie) nach Zugabe von Trimodulin gemessen, wobei eine deutliche Reduktion der Zytotoxizität von Ramos-Zellen festgestellt werden konnte. Diese Ergebnisse zeigten erstmalig, dass Trimodulin dazu in der Lage ist, aktivierte Komplementfaktoren zu hemmen, was zur Verhinderung von Entzündungsreaktionen bei Patienten mit einer überstimulierten Immunantwort eingesetzt werden könnte. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse ebenfalls deutlich die Vorteile der Verwendung von Trimodulin zur Reduzierung der Überstimulation des Komplementsystems, gegenüber einem Standard-IVIg-Präparat auf, welches keine verminderte Zytotoxizität in diesem Test bewirkte. Weiterführend wurden zwei Opsonophagozytose-Tests (OPAs) entwickelt, um zu analysieren, ob Trimodulin, welches neben IgG und IgA auch ⋲ 23% IgM enthält, dazu in der Lage ist, das Komplementsystem zu aktivieren und die Opsonophagozytose von Krankheitserregern zu induzieren. Generell können IgM Moleküle das Komplementsystem im klassischen Weg deutlich effektiver aktivieren als IgG Moleküle. Der Opsonophagozytose-Test, der mit lebenden E. coli Bakterien durchgeführt wurde, war allerdings nicht dazu geeignet die Aktivierung des Komplementsystems und die damit verbundene Einleitung der Opsonophagozytose durch Trimodulin zu zeigen. Es wurde ausschließlich die IgG-vermittelte Phagozytose der Bakterien detektiert. Weiterhin wurde vermutet, dass dies auf eine starke unspezifische Abtötung durch die verwendete Komplementquelle zurückzuführen ist, die auch in Abwesenheit von Trimodulin eine große Anzahl an E. coli Bakterien neutralisierte. Aus diesen Gründen wurde ein zweiter Opsonophagozytose-Test unter Verwendung von S. aureus Biopartikeln etabliert und die Fähigkeit von Trimodulin Opsonophagozytose einzuleiten, in einem Durchflusszytometer (FACS) evaluiert. Die Analyse zeigte, dass Trimodulin dazu in der Lage war, das Komplementsystem konzentrationsabhängig zu aktivieren und dadurch die Opsonophagozytose von S. aureus Biopartikeln durch Effektor Zellen (HL-60-Zelllinie) in niedrigen Konzentrationen auszulösen. Zusätzlich wurde festgestellt, dass Trimodulin in hohen Dosen auch im Opsonophagozytose-Test das Komplementsystem hemmte. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit unterstützen die Theorie, dass Trimodulin eine ambivalente Wirkung hinsichtlich der Komplementaktivierung besitzt und stehen im Einklang mit verschiedenen Studien, die ebenfalls duale Mechanismen von Ig-Präparaten hinsichtlich der Aktivierung und der Hemmung des Komplementsystems zeigen. Darüber hinaus wird vermutet, dass die Behandlung mit Trimodulin dazu beitragen könnte, Entzündungsreaktionen, die durch eine Überstimulation des Komplementsystems verursacht werden, zu reduzieren und gleichzeitig die Neutralisierung schädlicher Krankheitserreger sicherzustellen. Des Weiteren gibt die Arbeit durch die Bestätigung der Aktivierung sowie Inhibierung des Komplementsystems durch Trimodulin neue Einblicke in dessen Wirkungsweise und zeigt entscheidende Vorteile der Verwendung eines IgM- und IgA-angereicherten Präparats im Vergleich zu einem Standard-IVIg-Präparat auf.German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: VII, 108 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 16 Dec 2020 15:11
Last Modified: 17 Dec 2020 01:54
DOI: 10.25534/tuprints-00015398
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-153986
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Schüttrumpf, PD Dr. Jörg
Refereed: 23 November 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/15398
Export:
Actions (login required)
View Item View Item