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DARPin-targeted Chimeric Antigen Receptor T cells: CD4 as a cellular target shows potential to evade HIV latency reservoir

Patasic, Lea (2020):
DARPin-targeted Chimeric Antigen Receptor T cells: CD4 as a cellular target shows potential to evade HIV latency reservoir.
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00013332,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: DARPin-targeted Chimeric Antigen Receptor T cells: CD4 as a cellular target shows potential to evade HIV latency reservoir
Language: English
Abstract:

Specific targeting of HIV infected cells has been a challenge since the discovery of the virus. To date, antiretroviral therapy is capable of inhibition of viral spread and controlling the viral load at levels below detection limit. However, the latent viral reservoir persists even during intensive treatment, and produces new infectious viral particles as soon as medication is discontinued. But antiretroviral therapy is cost-intensive, causes major side effects and involves close monitoring of the patient. Relapse due to viral mutation may also require multiple changes in the medication strategy. It is therefore essential for a sustainable cure, to also fully eliminate the latent viral reservoir. Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell therapy has been very suc-cessful in the treatment of hematologic malignancies. Autologous T cells of patients are genetically modified to express a chimeric receptor, which enables them to specifically bind their tar-get antigen and deplete the target cell without the need of MHC-presentation. Transferring this CAR-T cell technology from targeting of malignant B cells to HIV-infected T cells could potentially be the way to a sterilising cure. However, the development of anti-HIV CAR-T cells has been dormant in the past years due to lack of efficiency, and because targeting of viral proteins on the surface of infected cells did not deplete the latent viral reservoir, hence did not show any improvement compared to conventional antiretroviral therapy. Fast progress in recent development of next generation CARs led to significant enhancement of efficacy and specificity. In addition to that, targeting of cellular rather than viral proteins could potentially overcome persistence of the latent reservoir. Therefore, CD4 as the exclusive HIV entry receptor into the host cell could be a suitable cellular target for anti-HIV CAR-T cells, because all infected cells express CD4, including the latent reservoir. One aim of this thesis was to investigate whether CAR-T cells can specifically and efficiently deplete their CD4-positive target cell population. Therefore, a second-generation CAR was utilised, bearing CD3zeta and CD28 co-stimulatory domains, as successfully used in clinical trials. A CD4-specific Designed Ankyrin Repeat Protein (DARPin) was used as a binding domain, since this molecule was shown to be small, well expressed on the cell surface, specific and not immunogenic. Generation of an expression plasmid, encoding all CAR domains in a cassette system, provided a platform for flexible and individual CAR design. Transduction of primary human T cells with gamma-retroviral particles led to CAR expression on the cell surface. Co-culture resulted in dose-dependent CAR-mediated T cell activation and cytotoxicity towards target but not towards non-target cells, verifying specificity and potency of anti-CD4-DARPin CAR-T cells. High efficiency was shown during co-culture with non-target cells including de-creasing amounts of target cells. CD4 specific cytotoxicity was also observed against very low target cell levels. Human CD4 was selected as a target because it is the entry receptor for HIV into the host cell, and therefore expressed on all HIV-positive cells, irrespectively of their activation state. Another question of this thesis was therefore, if CD4-specific CAR-T cells have the potential to deplete the CD4-positive T cell compartment and thereby also the latent HIV reservoir. Anti-CD4-DARPin CAR-T cells showed efficient and specific cytotoxicity against an HIV-latency model - towards activated, as well as latently infected cells with low levels of target expression. Furthermore, CD4 T cells were efficiently depleted in an autologous setup, without major impact on the CD4-negative T cell population. Taken together, anti-CD4-DARPin CAR-T cells have shown specificity, efficiency and potency, the main properties, required for success-ful CAR-T cell therapy. With regard to further investigation of this approach in an immunocompetent animal model, anti-CD4-DARPin CARs were not only expressed on human, but also non-human primate T cells. Moderate depletion of autologous CD4 target cells was observed using T cells of rhesus macaques, providing the groundwork to test this approach in a well-established immunocompetent animal model. In summary, the results of this work provide evidence, that anti-CD4-DARPin CAR-T cells are a promising approach to specifically deplete potential HIV host cells, along with elimination of latently infected cells. This was achieved by combination of a potent 2nd generation CAR, driving efficient T cell activation with a specific and well expressed DARPin binding domain, target-ing a cellular protein to capture all potentially HIV-positive cells, including those in a latent stage. These data provide a basis for further investigation of anti-CD4-DARPin CAR-T cells for HIV therapy.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Seit der Entdeckung des HI-Virus stellt das spezifische Targeting infizierter Zellen eine der größten Herausforderungen dar. Antiretrovirale Therapie ist mittlerweile in der Lage, die Verbreitung des Virus im Patienten zu inhibieren und die Viruslast unter dem Detektionslimit zu halten. Allerdings bleibt das latente Virusreservoir trotz intensiver Therapie bestehen und be-ginnt mit der Produktion neuer infektiöser Partikel, sobald die Medikation eingestellt wird. Dau-erhafte antiretrovirale Therapie ist jedoch kostenintensiv, verursacht häufig starke Nebenwirkungen und bedarf einer engmaschigen Überwachung der Patienten. Rückfälle aufgrund von Virusmutationen können auch mehrfach Änderungen der Medikationsstrategie erforderlich machen. Um eine nachhaltige Heilung zu erreichen ist es daher essentiell, auch das latente virale Reservoir vollständig zu auszulöschen. Die Therapie mit Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Zellen ist derzeit äußerst erfolgreich in der Behandlung von Blutkrebs. Autologe T-Zellen von Patienten werden hierfür genetisch modifiziert um einen chimären Rezeptor zu exprimieren, der diese dazu befähigt, spezifisch an ihr Zielantigen zu binden und die Zielzelle zu zerstören, ohne dass das Zielantigen dafür auf dem MHC-Komplex präsentiert werden muss. Die Über-tragung dieser CAR-T-Zell-Technologie von der Behandlung maligner B-Zellen auf HIV-infizierte T-Zellen könnte potentiell der Weg zu einer vollständigen Heilung sein. Allerdings ist die Entwicklung von anti-HIV CAR-T-Zellen in den letzten Jahren kaum vorangeschritten. Gründe hierfür waren vor allem mangelnde Effizienz, sowie der Umstand, dass das Ansteuern viraler Proteine auf der Oberfläche infizierter Zellen das latente virale Reservoir nicht ein-schließt. Verglichen mit herkömmlicher antiretroviraler Therapie ergab sich dadurch kein nen-nenswerter Vorteil der CAR-T-Zellen. Mit der Entwicklung von CARs fortgeschrittener Generationen, wurden Wirksamkeit und Spezifität enorm verbessert. Zusätzlich dazu, könnte die Wahl eines zellulären statt eines viralen Zielproteins möglicherweise auch das latente virale Reser-voir eliminieren. Weil CD4 der exklusive Eintrittsrezeptor für HIV in die Wirtszelle ist und somit alle infizierten Zellen, inclusive des latenten Reservoirs, CD4 exprimieren, könnte dieser ein passendes Zielantigen für anti-HIV CAR-T-Zellen sein. Ein Ziel dieser Dissertation war es, herauszufinden ob CAR-T-Zellen in der Lage sind, ihre CD4-positive Zielzellpopulation effizient zu depletieren. Hierfür wurde ein CAR der zweiten Generation mit CD3zeta- und CD28 Co-Aktivierungsdomäne genutzt, wie auch in verschiedensten erfolgreichen klinischen Studien. Ein CD4-spezifisches Designed Ankyrin Repeat Protein (DARPin) wurde als Bindedomäne eingesetzt. Dieses Molekül gilt als klein, gut auf Zelloberflächen zu exprimieren, spezifisch und nicht immunogen. Die Herstellung eines Ex-pressionsplasmids, welches alle CAR-Domänen in einem Kassettensystem codiert, lieferte die Plattform für flexibles und individuelles Design verschiedener CARs. Transduktion primärer humaner T-Zellen mit Gamma-Retroviralen Transfervektorpartikeln führte schließlich zur CAR-Expression auf deren Zelloberfläche. Co-Kultivierung führte zu dosisabhängiger, CAR-vermittelter T-Zell-Aktivierung und Zytotoxizität gegenüber antigen-positiven, nicht aber ge-genüber antigen-negativen Zielzellen. Somit konnten Spezifität und Wirksamkeit von anti-CD4-DARPin CAR-T-Zellen verifiziert werden. Eine hohe Effizienz zeigte sich auch während der Kultivierung mit antigen-negativen Zellen, denen antigen-positive Zielzellen in abnehmender Konzentration beigefügt wurden. CD4-spezifische Zytotoxizität war auch dann noch gegeben, wenn die Zielzellen nur in sehr geringer Menge vorhanden waren. Humanes CD4 wurde als Zielantigen ausgewählt, weil es als Eintrittsrezeptor in die Wirtszelle fungiert und somit auf allen HIV-positiven Zellen exprimiert wird, unabhängig von deren Aktivierungszustand. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war daher, festzustellen ob CD4-spezifische CAR-T-Zellen in der Lage sind, mit der CD4-positiven Zellpopulation auch das latente virale Reservoir zu depletieren. Anti-CD4-DARPin CAR-T-Zellen zeigten effiziente und wirksame Zytotoxizität gegenüber einem HIV-Latenzmodell – sowohl im aktivierten, als auch im latenten Zustand mit geringer Antigenexpression. Darüber hinaus wurden auch autologe CD4 T-Zellen effizient depletiert, ohne erkennbare Auswirkungen auf die CD4-negative T-Zellpopulation. Insgesamt zeigten anti-CD4-DARPin CAR-T-Zellen Spezifität, Effizienz und Wirksamkeit – die Haupteigenschaften für eine erfolgreiche CAR-T-Zell-Therapie. Um diesen Ansatz in einem immunkompetenten Tiermodell weiter zu untersuchen, wurden anti-CD4-DARPin CARs nicht nur in humanen, sondern auch in T-Zellen von nicht-humanen Primaten exprimiert. Autologe CD4-Zielzellen von Rhesusaffen wurden im mittleren Maße depletiert und dienen als Grundlage, um diesen Ansatz in einem etablierten immunkompetenten Tiermodell zu testen. Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen, dass anti-CD4-DARPin CAR-T-Zellen ein vielversprechender Ansatz sind, gezielt potenzielle HIV Wirtszellen zu depletieren und dabei auch latent infizierte Zellen zu eliminieren. Dies wurde erreicht durch die Kombination eines potenten CAR der zweiten Generation, welcher T-Zellen effizient mittels einer gut exprimierten DARPin-Bindedomäne aktiviert. Gleichzeitig werden durch das Ansteuern eines zellulären Zielproteins alle potenziell HIV-positiven Zellen erfasst, inklusive derer, die sich im Stadium der Latenz befinden. Diese Daten bieten eine Grundlage zur weiteren Erforschung von anti-CD4-DARPin CAR-T Zellen zur Behandlung von HIV.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Molecular Genetics
10 Department of Biology > Postranscriptional Gene Regulation and RNA Therapeutics
Date Deposited: 01 Sep 2020 11:24
Last Modified: 01 Sep 2020 14:56
DOI: 10.25534/tuprints-00013332
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-133324
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Löwer, Prof. Dr. Alexander and Cichutek, Prof. Dr. Klaus and Abken, Prof. Dr. Hinrich
Refereed: 6 September 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/13332
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